蘇雪嬌，王秀峰，張 悅，王學國，王健鸝，藤 巍，宋述堯

(1吉林農業(yè)大學 園藝學院，吉林 長春 130118；2吉林省蔬菜花卉科學研究院，吉林 長春 130033)

分蘗洋蔥(AlliumcepaL.varagrogatum Don.)別名毛蔥、鬼子蔥、分蘗蔥頭等，為蔥科蔥屬草本植物，其營養(yǎng)成分豐富，具有良好的保健功能，能提高人體免疫力和抗癌能力[1-4]。分蘗洋蔥是黑龍江省和吉林省重要的優(yōu)勢蔬菜品種之一，對農民增收起到了積極的促進作用[5]。然而由于其主要繁殖方式為營養(yǎng)繁殖，易受植物病毒病侵染，品種退化嚴重，很大程度上制約了分蘗洋蔥產業(yè)的健康發(fā)展[6-7]。此外，生產上分蘗洋蔥利用蘗生小鱗莖進行種苗繁殖，繁殖系數較低[8]。目前關于分蘗洋蔥組培快繁技術方面的研究還較少。選擇合適的外植體材料是組培快繁成功的關鍵，一般來說，莖尖組織分生能力較強，且莖尖分生組織中極少甚至無病毒分布[9]，徐啟江等[10]和陳典等[11]以莖尖組織為外植體經兩種不同途徑獲得了分蘗洋蔥再生植株，但增殖系數較低且周期較長，因此開辟蔥蒜類植物新的外植體材料受到了廣泛關注?？姿仄嫉萚12]以鱗莖盤為外植體誘導出了大蒜的簇生芽；董瑞等[13]研究發(fā)現，在MS+2 mg/L NAA+7.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上，新疆白皮蒜每個鱗莖盤不定芽生長最大值為39.22株，以鱗莖盤為外植體進行快繁不僅可以獲得較高的增殖效率,且較莖尖取材操作相對容易。然而，關于利用分蘗洋蔥鱗莖為外植體進行快繁的研究目前尚未見報道。為此，本試驗擬開展分蘗洋蔥莖尖啟動、微鱗莖盤增殖及生根馴化等關鍵技術研究，旨在建立脫毒、較高效的分蘗洋蔥快繁體系，為分蘗洋蔥種苗的快繁提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選取吉林省公主嶺市懷德鎮(zhèn)地方分蘗洋蔥品種為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 莖尖啟動培養(yǎng) 將分蘗洋蔥種球外層鱗莖逐層剝下，剝至長度2 cm左右，用自來水沖洗30 min，再于超凈工作臺內，用體積分數75%乙醇浸泡30 s，質量分數1%次氯酸鈉浸泡13 min，無菌水沖洗3～5次，備用。

以MS(蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L)為基礎培養(yǎng)基，在基礎培養(yǎng)基中添加不同激素組成啟動培養(yǎng)基，用以誘導成苗，培養(yǎng)基配方共設6個處理，詳見表1。將經過消毒的外植體在無菌條件下，利用顯微鏡剝離出0.3 mm大小的莖尖組織，用于接種。每個處理接種40個莖尖，3次重復。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計成苗數和成苗率并測量株高莖粗。培養(yǎng)條件為：溫度20～25 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間16 h/d，以下試驗的培養(yǎng)條件與此相同。成苗率的計算公式為：

表1 分蘗洋蔥莖尖啟動培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of starter medium for tiller onion stem tip

成苗率=(成苗數/接種個數)×100%。

1.2.2 微鱗莖盤增殖培養(yǎng) 試管鱗莖誘導：待莖尖培養(yǎng)至成苗后，把通過RT-PCR技術檢測無洋蔥黃矮病毒的植株作為分蘗洋蔥快繁體系的原始種苗(試管苗脫毒率約為60%)。將原始種苗轉接至鱗莖誘導培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L NAA+45 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)中誘導結球。

微鱗莖盤增殖：當脫毒種苗試管微鱗莖直徑達到8 mm以上時，切去根及鱗莖盤以上部分，去除主生長點后將鱗莖盤切割成4份，分別接種于以MS(附加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L)為基礎培養(yǎng)基，添加不同質量濃度的6-BA(0.1，0.4，1.0 mg/L)與NAA(0.1，1.0，2.0 mg/L)組合和6-BA(0.1，0.4，1.0 mg/L)與IAA(0.1，1.0，2.0 mg/L)組合的增殖培養(yǎng)基中，誘導叢生芽，4周后統(tǒng)計分化芽總數，計算平均增殖系數。每個配方接種20個1/4鱗莖盤，3次重復。平均增殖系數的計算公式為：

平均增殖系數=分化芽總數/接種塊數。

1.2.3 生根壯苗與移栽馴化 生根培養(yǎng)基配方設3個處理，分別為MS+0.1 mg/L NAA、1/2 MS+0.1 mg/L NAA和1/4 MS+0.1 mg/L NAA。將增殖后的組培苗分株接種于不同生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，誘導組培苗進行生根，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計生根率和生根數并測量根長。每個培養(yǎng)基配方接種30株，3次重復。生根率的計算公式為：

生根率=(已生根株數/接種個數)×100%。

將生根后的分蘗洋蔥組培苗移栽至穴盤中馴化，基質配比為V(草炭)∶V(田土)= 2∶1，覆膜保濕，在培養(yǎng)溫度20 ℃、相對濕度80%的條件下培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計成活率，并觀察后續(xù)田間生長情況。

1.3 數據分析

利用Excel 2019進行試驗數據統(tǒng)計，采用SPSS 20.0進行數據分析和Duncan’s多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 分蘗洋蔥莖尖啟動培養(yǎng)

由表2可以看出，分蘗洋蔥莖尖組織經過35 d培養(yǎng)后，在6種培養(yǎng)基上的成苗率和生長狀態(tài)有一定差異。分蘗洋蔥莖尖組織在A1培養(yǎng)基上的成苗率最高，為87.50%，顯著高于其他處理；植株的平均株高和莖粗也最大，分別為3.41和1.17 cm。A2和A3培養(yǎng)基中分別添加了0.4 mg/L 6-BA和0.8 mg/L 6-BA，分蘗洋蔥莖尖組織成苗率有所下降，分別為75.00%和67.50%，平均株高和莖粗也有所減小，其中平均株高顯著低于A1培養(yǎng)基，平均莖粗與A1培養(yǎng)基差異不顯著。A4和A5培養(yǎng)基中分別添加了0.4 mg/L ZT和0.8 mg/L ZT，分蘗洋蔥莖尖組織成苗率分別為77.50%和67.50%，平均株高分別為3.17 和2.78 cm，平均莖粗分別為1.06 和0.87 cm。分孽洋蔥莖尖組織在A6培養(yǎng)基上的成苗率最低，僅為57.50%，平均株高和莖粗也最小。由于莖尖組織在A1培養(yǎng)基上的成苗率最高且植株生長狀態(tài)最好，因此A1培養(yǎng)基為分蘗洋蔥的最佳莖尖啟動培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對分蘗洋蔥莖尖成苗及生長狀況的影響Table 2 Effects of different media on seedling formation and growth status of stem tip

2.2 分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖

2.2.1 微鱗莖盤的獲得 本試驗分蘗洋蔥增殖快繁是以試管微鱗莖盤為外植體進行的，因此需先對分蘗洋蔥原始種苗進行試管結球誘導以獲得試管微鱗莖。本試驗將原始種苗接種于MS+0.1 mg/L NAA+45 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中誘導結球，培養(yǎng)8周后獲得了直徑大于8 mm的試管微鱗莖。圖1為分蘗洋蔥微鱗莖盤獲得流程，其中圖1-a為經結球誘導后的試管微鱗莖，圖1-b-d為分蘗洋蔥微鱗莖切割過程圖。首先將分蘗洋蔥試管苗的根部切除，再將鱗莖盤以上部分去除，最后將鱗莖盤上的主生長點去除后切割成4份，分別接種于添加不同質量濃度的6-BA與NAA組合和6-BA與IAA組合的增殖培養(yǎng)基上誘導叢生芽。

2.2.2 不同激素組合對分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖的影響 將切割后的分蘗洋蔥鱗莖盤接種于增殖培養(yǎng)基上，隨著誘導時間的延長，微鱗莖盤分化數增加，經2周培養(yǎng)后，在顯微鏡下觀察到了叢生芽的分化；3周后，叢生芽株高最大可達1 cm；4周后叢生芽株高可達3 cm，分化數達到最大值(圖2)。

a.試管微鱗莖；b.切除根部；c.切除鱗莖盤以上部分；d.鱗莖盤切割4份a.Micro-squamous tube;b.Removal of roots;c.Removal of upper bulbous disk;d.Scale stalk cut 4 parts圖1 分蘗洋蔥微鱗莖盤的獲得流程Fig.1 Process of obtaining micro-squamous stem disc of tiller onion

a.培養(yǎng)2周；b.培養(yǎng)3周；c.培養(yǎng)4周a.Culture for 2 weeks;b.Culture for 3 weeks;c.Culture for 4 weeks圖2 分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖Fig.2 Multiplication of tiller onion microscale

由表3可知,6-BA與NAA組合對分蘗洋蔥微鱗莖盤誘導增殖的效果優(yōu)于6-BA與IAA組合。不同質量濃度的6-BA與NAA組合對分蘗洋蔥微鱗莖盤的增殖誘導效果存在明顯差異，隨NAA質量濃度增加，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增殖系數普遍下降；當6-BA質量濃度為0.4 mg/L時，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增值系數普遍較高。6-BA與NAA組合中，分蘗洋蔥微鱗莖盤在添加0.4 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上分化芽總數和平均增殖系數最大，平均增殖系數達16.05，顯著高于其他處理。

表3 不同激素組合對分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖的影響Table 3 Effect of different hormone combinations on growth of microscale disk of tiller onion

由表3還可知，不同質量濃度的6-BA與IAA組合也可以誘導出叢生芽，但增殖系數較低，且增殖苗存在畸形苗。同樣隨IAA質量濃度的增加，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增殖系數普遍下降；當6-BA質量濃度為0.4 mg/L時，分蘗洋蔥微鱗莖盤平均增殖系數普遍較高；6-BA與IAA組合中分蘗洋蔥微鱗莖盤在添加 0.4 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IAA的培養(yǎng)基中，分化芽總數和平均增殖系數最大，平均增殖系數達13.05，顯著高于其他處理。綜合考慮認為MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為分蘗洋蔥微鱗莖盤增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.3 分蘗洋蔥生根壯苗與移栽馴化

由表4可知，將增殖后的分蘗洋蔥苗分株接種于不同生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后各培養(yǎng)基上分蘗洋蔥的生根率均達100%，但根的生長狀況存在一定差異。D1培養(yǎng)基上的組培苗平均生根數較多，但根長較短；D2培養(yǎng)基上的組培苗平均生根數最多，顯著高于D1和D3培養(yǎng)基；D3培養(yǎng)基上的組培苗平均根長最大，與D2培養(yǎng)基差異不顯著，但D3和D2培養(yǎng)基均顯著高于D1培養(yǎng)基。綜合分析認為，D2培養(yǎng)基為分蘗洋蔥組培苗的最佳生根培養(yǎng)基。

表4 不同生根培養(yǎng)基對分蘗洋蔥生根的影響Table 4 Effect of different rooting medium on rooting of tiller onion

圖3為分蘗洋蔥組培苗田間馴化結果，圖3-a為生根后的分蘗洋蔥組培苗，圖3-b為移栽至穴盤的組培苗。將生根后的分蘗洋蔥組培苗移栽到穴盤中，基質為V(草炭)∶V(田土)=2∶1，覆膜保濕，在20 ℃、相對濕度80%條件下培養(yǎng)20 d后，分蘗洋蔥組培苗成活率在95%以上。與正常鱗莖種植相比，組培苗后續(xù)田間長勢較好，且生長期相對延長，分蘗數4～6個，鱗莖平均質量為25～30 g。

a.分蘗洋蔥組培苗；b.組培苗穴盤栽培a.Seedling culture of tiller onion;b.Cultivation of tissue culture圖3 分蘗洋蔥組培苗的田間馴化栽培Fig.3 Field domestication cultivation of tiller onion tissue culture seedlings

3 討論與結論

在本試驗條件下，分蘗洋蔥最佳莖尖啟動培養(yǎng)基為MS+0.1 mg /L NAA，成苗率為87.50%。關于分蘗洋蔥最佳莖尖啟動培養(yǎng)基已有一些報道，徐啟江[8]研究表明，分蘗洋蔥最佳誘芽培養(yǎng)基為 MS+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L BA。姜玉東[14]研究表明，MS+0.1 mg/L NAA+0.7 mg/L BA和MS+0.1 mg/L NAA+0.7 mg/L zip培養(yǎng)基都適合分蘗洋蔥的誘芽培養(yǎng)。王健鸝等[15]研究表明，分蘗洋蔥最佳莖尖啟動培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L zip。以上結果說明，分蘗洋蔥最佳莖尖啟動培養(yǎng)基中的最佳NAA質量濃度均為0.1 mg/L，這與本試驗結果相一致，所不同的是添加的其他植物生長調節(jié)劑種類和質量濃度有差別，造成這種差異的原因可能與莖尖培養(yǎng)時所采用的分蘗洋蔥品種和所處發(fā)育時期不同有關，不同的分蘗洋蔥品種和所處時期會導致其內源激素水平差異，進而導致莖尖啟動培養(yǎng)時選擇的培養(yǎng)基激素種類和水平有所差異。本試驗進行莖尖啟動培養(yǎng)是為了獲得生長狀況較好的分蘗洋蔥植株，在培養(yǎng)基中添加6-BA、ZT等激素會促使莖尖啟動時產生芽的分化，影響植株生長狀況。因此本試驗通過比較確定，只添加0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基為最佳莖尖啟動培養(yǎng)基，不僅能有效節(jié)約生產成本，同時也提高了誘導效率。

本試驗首次利用分蘗洋蔥微鱗莖盤為外植體進行增殖，研究結果表明，分蘗洋蔥1/4微鱗莖盤在MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA增殖培養(yǎng)基上的平均增殖系數可達16.05，相當于1個鱗莖盤平均增殖系數可高達64.20。前人研究表明，莖尖外植體分化不定芽平均最大為3.1，莖尖愈傷組織分化形成的芽最多為14個[10-11]，因此本試驗很大程度上提高了分蘗洋蔥的快繁效率。目前，利用鱗莖盤作為外植體增殖在大蒜、朱頂紅和洋蔥等植物上已有一些報道[16-19]。董瑞等[20]研究表明，在MS+1.799 mg/L NAA+7.50 mg/L 6-BA增殖培養(yǎng)基上，伊寧紅皮蒜每個鱗莖盤不定芽生長平均值可達22.92株。陳漢鑫等[21]研究表明，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA增殖培養(yǎng)基上，朱頂紅鱗莖盤的增殖系數達5.62倍。潘美紅等[19]研究表明，以連蔥15號鱗莖盤為外植體，在MS+7 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基上的增殖效果最好。本試驗與前人研究結果均表明，利用鱗莖盤進行快繁可以獲得較高的增殖效率。本試驗建立的分蘗洋蔥微鱗莖盤快繁體系主要流程是分蘗洋蔥經莖尖啟動后獲得組培苗，再經結球誘導后進行鱗莖盤增殖，待鱗莖盤增殖的苗長至3～5 cm時進行分株結球培養(yǎng)，然后再進行鱗莖盤增殖，這樣反復循環(huán)。此過程不僅可以提高分蘗洋蔥的快繁效率，同時能縮短種苗的增殖周期。

試管苗的生根馴化是脫毒種苗生產的最后一步。前人研究表明，MS+1.5 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA、MS+2.5 mg/L IBA和1/2 MS+0.1 mg/L PP333+0.01 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA等培養(yǎng)基都適合分蘗洋蔥的生根培養(yǎng)[6,10,14]。本試驗研究表明：在本試驗條件下，分蘗洋蔥最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg /L NAA，以單獨添加NAA為分蘗洋蔥的最佳生根培養(yǎng)基，這與前人研究結果不同。以往研究表明，NAA、IBA和PP333等激素都有促進植物生根的作用，前期誘導組培苗的外植體種類和誘導條件影響組培苗內在激素水平和生長狀態(tài)，進而導致誘導生根所需要的條件不同[22-25]。本試驗在移栽基質為V(草炭)∶V(田土)= 2∶1及覆膜保濕條件下，保持培養(yǎng)溫度為20 ℃，相對濕度為80%，經馴化20 d后分蘗洋蔥組培苗成活率在95%以上。

本試驗以分蘗洋蔥鱗莖盤為外植體進行增殖誘導，建立了分蘗洋蔥組培苗快繁技術體系，提高了種苗快繁的增殖系數，反復循環(huán)結球增殖環(huán)節(jié)，縮短了種苗增殖周期，可為分蘗洋蔥的種苗快繁研究提供一定的參考。