皮勝玲，郭小蘭，劉密，李偉，劉湘*（.湘潭市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 湘潭 400；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 40208）

夏枯草Prunella vulgarisL.為唇形科夏枯草屬多年生草本植物，以干燥果穗入藥，為我國(guó)常用中藥材，自1963年版《中國(guó)藥典》起，中國(guó)歷屆藥典都收載了夏枯草[1]。夏枯草常用于治療目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳癖、乳房脹痛等，現(xiàn)代研究表明夏枯草中主要的活性成分為三萜及其苷、酚酸、黃酮及多糖類，其中的酚酸類具有抗病毒、抗氧化及抗腫瘤等生物活性[2]。

夏枯草作為藥食兩用中藥，近幾年被廣泛用于“王老吉”“加多寶”等多種涼茶的制作生產(chǎn)，以夏枯草為原料的中成藥及保健產(chǎn)品也如雨后春筍般層出不窮。以往夏枯草主要以野生品種供應(yīng)市場(chǎng)，而近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)夏枯草的需求量越來(lái)越大，夏枯草人工規(guī)范化栽培已成為趨勢(shì)[3-4]。目前《中國(guó)藥典》收載的入藥部位為果穗，而經(jīng)考證，夏枯草藥用部位經(jīng)歷了帶穗全草、果穗及帶穗全草、單用半枯或成熟果穗3 個(gè)時(shí)期[5]。也有研究表明，夏枯草果穗的最佳采收期在6月下旬，莖葉的最佳采收期為5月底，葉中的活性成分含量接近果穗中活性成分的含量，認(rèn)為夏枯草全草具一定的入藥價(jià)值[6]。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定野生與栽培夏枯草全草不同生長(zhǎng)發(fā)育期的指紋圖譜及3 種酚酸成分的含量，為確定夏枯草全草的最佳采收期及全草的藥用價(jià)值提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品及其來(lái)源

供試野生與栽培夏枯草全草共20 份，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)王智副教授鑒定為唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的全草，試驗(yàn)設(shè)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥植園夏枯草種植基地，地理坐標(biāo)為E 112°54'，N 28°08'，海拔88 m。試驗(yàn)地土壤為砂質(zhì)黃壤土，肥力中等。2017年3月在3 塊試驗(yàn)地上播種，夏枯草種子由湖南中醫(yī)藥大學(xué)王智副教授提供，播種前施入有機(jī)復(fù)合肥作為底肥一次性施入土壤。于2018年3月—6月在夏枯草種植基地設(shè)置采樣區(qū)，每次隨機(jī)采集栽培夏枯草植株5 ～20 株（含根），同時(shí)采集原本生長(zhǎng)在藥植園其他區(qū)域的野生夏枯草植株（含根），并在夏枯草生長(zhǎng)期間觀察植株生育期進(jìn)程并記錄。栽培夏枯草3—4月份每間隔約15 d 采集一次，進(jìn)入成熟期后間隔約7 d 或3 d 采集一次，因野生夏枯草數(shù)量有限，從5月份開始采集，栽培樣品共采集11 次，野生樣品共采集9 次。全草樣品于陽(yáng)光下曬干，粉碎混勻后過(guò)篩（40 目），編號(hào)裝袋保存。材料信息如表1所示。

1.2 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀（沃特世公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；萬(wàn)分之一CP114 型電子分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京國(guó)華醫(yī)療器械廠）；0.22 μm 微孔濾膜（上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司）。

表1 野生與栽培夏枯草全草供試樣品Tab 1 Samples of wild and cultivated Prunella vulgaris L.

迷迭香酸（批號(hào)：140318，純度＞98%）、咖啡酸（批號(hào)：140107，純度＞98%）（四川維克奇公司），異迷迭香酸苷（課題組自制，經(jīng)HPLC 檢測(cè)，純度＞98%），乙醇、甲醇均為分析純，乙腈和甲醇為色譜純，試驗(yàn)用水均為超純水（18.25 MΩ·cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 ACQUITYUPLC@BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫30℃，流速0.3 mL·min－1，進(jìn)樣量1 μL，波長(zhǎng)280 nm，流動(dòng)相為A 為甲醇，B 為0.1%甲酸水，梯度洗脫，具體洗脫程序如表2，色譜圖見圖1。

表2 UPLC 梯度洗脫Tab 2 UPLC gradient elution

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取夏枯草藥材粗粉約0.1 g，加入20 mL 70%甲醇提取溶劑，水浴回流提取30 min，冷卻稱重，70%甲醇補(bǔ)足重量，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

圖1 混合對(duì)照品（A）和夏枯草樣品（B，Z8）的UPLC 圖Fig 1 UPLC chromatogram of mixed control（A）and Prunella vulgaris L.samples（B，Z8）

分別精密稱取對(duì)照品異迷迭香酸苷0.0021 g，迷迭香酸0.0022 g 和咖啡酸0.0024 g，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，配制成含異迷迭香酸苷0.21 mg·mL－1、迷迭香酸0.22 mg·mL－1和咖啡酸0.24 mg·mL－1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4 野生與栽培夏枯草藥材3 種酚酸成分測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL 置于5 mL 量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，得到不同濃度對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍，見表3。

表3 3 種成分線性方程Tab 3 Linear equations of 3 components

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一份夏枯草供試品溶液（Z8）連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果咖啡酸、異迷迭香酸苷和迷迭香酸3 種成分的峰面積RSD分別為0.32%、1.1%和1.3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份夏枯草供試品溶液（Z8），分別于樣品制備后的0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果溶液中咖啡酸、異迷迭香酸苷和迷迭香酸3 種成分峰面積RSD分別為1.7%、2.1%和1.5%。表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取Z8 藥材約0.1 g 共6 份，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定咖啡酸、異迷迭香酸苷和迷迭香酸的峰面積RSD分別為2.0%、2.7%和2.2%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的夏枯草藥材（Z11）粉末約0.1 g，精密稱定，平行6 份，分別加入0.5 mL 的同一對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量并計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果表明咖啡酸、異迷迭香酸苷和迷迭香酸3 種成分的加樣回收率均值分別為99.6%、100.2%、99.4%，RSD分別為1.6%、1.2%、1.3%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.6 樣品測(cè)定 精密稱取20 份夏枯草樣品，分別將11 批栽培品和9 批野生品按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 野生與栽培夏枯草全草不同生長(zhǎng)期中3 種成分的含量Tab 4 Contents of 3 components in wild and cultivated Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.5 野生與栽培夏枯草UPLC 圖譜的建立

選取栽培樣品Z1 為參照?qǐng)D譜，導(dǎo)入20 批樣品UPLC 數(shù)據(jù)及圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 版）軟件進(jìn)行處理，建立具有18 個(gè)峰的野生與栽培不同生長(zhǎng)期的UPLC共有模式（見圖2），通過(guò)與對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照，確定4 號(hào)峰為咖啡酸，9 號(hào)峰為異迷迭香酸苷，10號(hào)峰為迷迭香酸。

圖2 野生與栽培夏枯草全草不同生長(zhǎng)期對(duì)照?qǐng)D譜Fig 2 Reference fingerprint of wild and cultivated Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.6 數(shù)據(jù)分析

2.6.1 野生與栽培夏枯草不同生長(zhǎng)期3 種酚酸成分變化趨勢(shì)圖 將表4的數(shù)據(jù)分別以各指標(biāo)性成分的含量為縱坐標(biāo)，以不同采收月份為橫坐標(biāo)，繪制野生與栽培夏枯草3 種酚酸成分隨采收月份變化的趨勢(shì)圖（見圖3）。如圖所示，栽培和野生夏枯草中3 種酚酸成分含量隨月份變化的趨勢(shì)大致相同，其中異迷迭香酸苷、迷迭香酸含量從3月到6月逐月累積，到6月10日最高，之后逐漸下降。

圖3 栽培（A）和野生（B）夏枯草全草不同生長(zhǎng)期3 種成分含量變化趨勢(shì)圖Fig 3 Variation of the contents of 3 components in cultivated（A）and wild（B）Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.6.2 兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn) 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)同一時(shí)期的野生與栽培夏枯草樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，通過(guò)分析得到3 種成分均具有方差齊性（P＞0.05）的特點(diǎn)。但對(duì)同一生長(zhǎng)時(shí)期的野生與栽培夏枯草而言，3 種成分的含量在野生品與栽培品之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6.3 聚類分析 以20 批夏枯草樣品中18 個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 21.0 軟件對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析（見圖4）。以歐式距離為測(cè)度，采用Ward 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果樣品被聚成單獨(dú)兩類，a 類為不同生長(zhǎng)期的野生夏枯草樣品，b 類為不同生長(zhǎng)期的栽培夏枯草樣品。

圖4 不同生長(zhǎng)期野生與栽培夏枯草系統(tǒng)聚類圖Fig 4 Clustering diagram of wild and cultivated Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.6.4 偏最小二乘判別分析 為進(jìn)一步評(píng)價(jià)野生與栽培夏枯草不同生長(zhǎng)期的成分含量差異，篩選導(dǎo)致樣品間差異的化學(xué)成分，以18 個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA-P13 軟件進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和變量投影重要性圖（variable importance plot，VIP）分析，建立PLS-DA 的3D 圖和VIP 圖（見圖5）。按PLS-DA的結(jié)果對(duì)18 個(gè)共有峰峰面積的VIP 值大小進(jìn)行排列，結(jié)果顯示5、4、10、16 和7 號(hào)色譜峰的VIP 值均大于1，表明以上化學(xué)成分對(duì)不同生長(zhǎng)期的野生與栽培夏枯草樣品差異性影響較大，其余色譜峰VIP 值小于1，對(duì)樣品的區(qū)分較小。其中4 號(hào)峰為咖啡酸，10 號(hào)峰為迷迭香酸。

3 討論

3.1 夏枯草全草的最佳采收時(shí)期

圖5 夏枯草樣品偏最小二乘判別分析3D 圖與VIP 圖Fig 5 3D and VIP plots of partial least squares discriminant analysis of Prunella vulgaris L.samples

本文研究結(jié)果表明，6月10日野生和栽培夏枯草全草中的迷迭香酸和異迷迭香酸苷的含量達(dá)到最高水平，咖啡酸含量也處于較高水平，確定6月10日左右為野生與栽培夏枯草全草的最佳采收期。而之前有研究表明夏枯草果穗的采收期在6月下旬為宜，莖葉的采收期為5月底，認(rèn)為全草的最佳采收期可將果穗和莖葉的最佳采收期進(jìn)行適宜的折中，本研究佐證了這一推測(cè)[6]。6月10日以后3 種成分的含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且6月10日以后整個(gè)植株開始枯萎，考慮所處地區(qū)氣候，如果下雨植株易倒伏。若過(guò)早采收，代謝產(chǎn)物積累不足，活性成分含量不高，如異迷迭香酸苷在3—4月間的積累量不足未達(dá)到檢測(cè)限；若過(guò)遲采收，則受到自身代謝和江淮地區(qū)梅雨期的影響，使活性成分減少，因此，本文研究認(rèn)為江淮地區(qū)夏枯草全草的最佳采收期為6月中上旬，在果穗半/全枯、植株未枯萎之際。

3.2 野生與栽培夏枯草全草的入藥價(jià)值

2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定夏枯草果穗迷迭香酸含量不少于0.2%，野生與栽培夏枯草全草的最佳采收期6月10日時(shí)的迷迭香酸含量均已達(dá)到藥典入藥標(biāo)準(zhǔn)，野生與栽培夏枯草全草均具一定的入藥價(jià)值。關(guān)于夏枯草的藥用部位，古代文獻(xiàn)記載與現(xiàn)代臨床應(yīng)用頗不一致，古人用夏枯草有用莖、葉者，也有用花者，而現(xiàn)在全國(guó)大多數(shù)地區(qū)銷售和臨床所用則以果穗為主導(dǎo)，目前已有研究表明夏枯草莖葉中的活性成分含量接近果穗中活性成分的含量，夏枯草全草的抗腫瘤作用不遜于夏枯草果穗[6-7]。而我國(guó)西南地區(qū)及東南亞地區(qū)仍有使用夏枯草全草的習(xí)慣，在歐洲和臺(tái)灣也多見夏枯草全草使用[2，8]。夏枯草全草入藥能提高夏枯草利用率，特別是在自然資源不足時(shí)，對(duì)于保護(hù)夏枯草野生資源、維護(hù)生態(tài)環(huán)境具一定的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本文確定了夏枯草全草的最佳采收期為6月中上旬，野生與栽培夏枯草全草3 種酚酸成分不同生長(zhǎng)期的含量差異不明顯，到采收期后兩者均具有入藥價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)夏枯草的研究較多，主要為單一成分研究，不夠深入，其藥理作用的研究也主要停留在粗提物，而且關(guān)于夏枯草中的單體化合物或某個(gè)部位的代謝的研究幾乎沒有[9-10]。本研究表明，夏枯草3 種酚酸成分隨不同采收月份的變化趨勢(shì)具有一致性，特別是迷迭香酸和異迷迭香酸苷，這提示在植物體內(nèi)這3 種成分的代謝過(guò)程可能具有相關(guān)性，需要進(jìn)一步深入研究。本研究系統(tǒng)地比較了野生與栽培夏枯草不同生長(zhǎng)時(shí)期化學(xué)成分的差異，明確了其變化趨勢(shì)，為確定夏枯草全草的適宜采收期提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為夏枯草藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和控制提供可靠的方法。