唐金蘭，陸燕飛，包一麟，趙遠(yuǎn)，尚林偉，尹建華*

(1 南京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，南京 211106;2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(浙江省腫瘤醫(yī)院)，中國(guó)科學(xué)院腫瘤與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310022)

1 引言

乳腺癌是威脅婦女生命健康的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。目前，常用的臨床檢查方法主要有影像學(xué)檢查、乳腺纖維導(dǎo)管鏡檢查、穿刺活檢和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等。影像學(xué)檢查有包括乳腺鉬靶檢查、超聲檢查、CT檢查和MRI掃描等[2]。這些常用的乳腺癌診斷方法存在各方面的優(yōu)勢(shì)及不足[3]，譬如，常用于無(wú)創(chuàng)診斷的影像學(xué)方法難于實(shí)現(xiàn)組織中主要成分變化的檢測(cè)和研究[2-3]；拉曼光譜可實(shí)現(xiàn)成分變化檢測(cè)和分子結(jié)構(gòu)研究，然而其信號(hào)通常較弱，且容易受到樣本熒光的影響[4]。因此，仍然需要一種準(zhǔn)確、高效的乳腺癌檢測(cè)方法，并可以在分子水平或微觀水平探索癌變機(jī)制，獲取原位的癌變信息。

傅里葉變換紅外(FTIR)光譜作為一種物理化學(xué)分析技術(shù)，在物理、化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在藥物、血漿、微生物和臨床病理學(xué)的研究中，它已被證明是一種靈敏的、方便的、具有較好重現(xiàn)性的技術(shù)[5-8]。然而，F(xiàn)TIR光譜實(shí)際檢測(cè)中往往通過(guò)使用不同的測(cè)量附件來(lái)適應(yīng)各種檢測(cè)對(duì)象[9]。當(dāng)前，衰減全反射(ATR)附件在紅外光譜測(cè)試中應(yīng)用十分廣泛，它無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，不破壞樣本，還可以檢測(cè)小顆粒樣本，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟。其原理是入射紅外光在晶體和樣本界面發(fā)生衰減全反射，此時(shí)晶體表面的消逝波進(jìn)入樣本淺表面發(fā)生指數(shù)式的衰減吸收，進(jìn)而使反射光攜帶一定的樣本信息。樣本淺表面(微米級(jí)深度)含水量較小，對(duì)整體光譜的影響大大降低[10]。特別是，通過(guò)光纖耦合ATR附件可以靈活地應(yīng)用于遠(yuǎn)程/外置樣本的實(shí)時(shí)及微小接觸面的紅外光譜檢測(cè)[11-12]。

此外，紅外光譜可以揭示生物組織的分子構(gòu)成和構(gòu)象，其光譜特征也可以反映分子間和分子內(nèi)部的相互作用以及含量變化[5]，利于進(jìn)行疾病的分析和檢測(cè)。因此，采用紅外光譜技術(shù)可有效檢測(cè)分析組織中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是對(duì)分子幾何形狀和氫鍵模式的微小變化高度敏感的酰胺I帶進(jìn)行分析，將對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成和構(gòu)象變化的研究非常有用[13]。

乳腺組織的癌變往往伴隨著組織中蛋白質(zhì)的組成、構(gòu)象、結(jié)構(gòu)的改變，通常每種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是不同類型二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合，組合形式復(fù)雜多樣，并且，不同種類蛋白質(zhì)中每種二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的比例不同[14]。因此本研究主要是通過(guò)使用自制的空心光纖(HOF)-ATR探針耦合FTIR光譜儀對(duì)健康和癌變?nèi)橄俳M織進(jìn)行測(cè)量，對(duì)所得紅外譜圖的酰胺I帶進(jìn)行光譜處理和分析，以研究健康和癌變組織的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異，并提供一種從分子水平上分析乳腺組織癌變機(jī)理、進(jìn)行原位檢測(cè)和精確識(shí)別乳腺癌的有效方法。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 樣本

實(shí)驗(yàn)所用的人體乳腺組織樣本由江蘇省腫瘤醫(yī)院提供，所有患者均被告知并同意這項(xiàng)研究。本次實(shí)驗(yàn)所用樣本來(lái)自12名女性患者，總共9個(gè)癌變?nèi)橄俳M織和9個(gè)健康乳腺組織(部分患者僅提供癌變組織)。在實(shí)驗(yàn)室對(duì)新鮮樣本表面脂肪組織進(jìn)行清理，即用于HOF-ATR-FTIR光譜采集。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器和數(shù)據(jù)采集

2.2.1中紅外空心光纖ATR耦合探頭

本文采用如圖1(A)所示的實(shí)驗(yàn)室自制的HOF-ATR探頭[11,14]對(duì)樣本組織進(jìn)行檢測(cè)。圖1(B)為截錐形 ATR 晶體設(shè)計(jì)圖，選擇ZnSe晶體作為探頭材料，外形為錐形圓臺(tái)，即后段為圓柱，前段為截頭圓錐(圓臺(tái))，上錐面與下錐面直徑分別為0.75 mm、2.5 mm，底部錐角為70°。光纖可以在困難的條件或是復(fù)雜的作業(yè)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行遠(yuǎn)程工作。利用全反射的原理將光束保留在光纖內(nèi)，并且沿著光纖方向前進(jìn)。選擇型號(hào)為HWEA7501200的中紅外空心光纖作為入射和出射光纖，波長(zhǎng)范圍為2.9～10.6 μm，光纖的內(nèi)徑為750 μm、玻璃層外徑為950 μm、緩沖層外徑為1200 μm。

圖1 (a)HOF-ATR 探頭結(jié)構(gòu)示意圖和(b)截錐形 ATR 晶體的設(shè)計(jì)圖

2.2.2數(shù)據(jù)采集

光譜信號(hào)收集時(shí)使用FTIR光譜儀(VERTEX70, Bruker)，配備了一個(gè)單點(diǎn)液氮制冷碲汞鎘(MCT)探測(cè)器，對(duì)樣本進(jìn)行HOF-ATR-FTIR光譜采集。首先檢測(cè)背景光譜，然后將HOF-ATR探針緊貼在組織表面進(jìn)行光譜采集。光譜采集范圍是4000～744 cm-1，掃描64次，分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣本至少取5個(gè)位置進(jìn)行光譜檢測(cè)。

2.3 光譜分析方法

采集141條光譜后，對(duì)之進(jìn)行基線校正和10點(diǎn)平滑處理，再基于酰胺I帶(1700～1600 cm-1)進(jìn)行進(jìn)一步分析。其中，酰胺I帶各子峰的峰位根據(jù)相應(yīng)的二階導(dǎo)數(shù)譜以及傅里葉去卷積譜結(jié)果確定，然后用Origin8.6軟件對(duì)酰胺I帶光譜進(jìn)行Gaussian函數(shù)擬合以驗(yàn)證峰位準(zhǔn)確性。

根據(jù)酰胺I帶中包含的5種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的光譜波數(shù)范圍，從曲線擬合圖中選擇屬于二級(jí)結(jié)構(gòu)波數(shù)范圍內(nèi)的、有效的子峰。把有效的子峰面積之和記為1，分別計(jì)算5種二級(jí)結(jié)構(gòu)面積所占的比例，即可得到乳腺組織酰胺I帶中各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量[9]，例如α-螺旋的含量可以用公式1計(jì)算：

α-螺旋=

(1)

式(1)中S表示面積，Sα-螺旋、Sβ-折疊、Sβ-轉(zhuǎn)角、S非典型螺旋和S無(wú)規(guī)卷曲分別表示為α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、非典型螺旋和無(wú)規(guī)卷曲5種二級(jí)結(jié)構(gòu)的面積，通過(guò)這個(gè)公式可以分別計(jì)算出健康和癌變?nèi)橄俳M織光譜酰胺I帶中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、非典型螺旋和無(wú)規(guī)卷曲的含量。

2.4 偏最小二乘判別(PLS-DA)

每條光譜均進(jìn)行基線校正處理。在Unscrambler X軟件(CAMO Software, Inc., Woodbridge, NJ)中將收集的141個(gè)FTIR光譜作為光譜矩陣用于PLS-DA。共五個(gè)患者的75條光譜被選作訓(xùn)練集，其中健康對(duì)照組光譜33條，癌變組織光譜42條。分別選取酰胺I帶(1700～1600 cm-1)和全波長(zhǎng)光譜(4000～744 cm-1)構(gòu)建兩個(gè)PLS-DA模型以識(shí)別乳腺組織。在這項(xiàng)研究中，當(dāng)計(jì)算的光譜分?jǐn)?shù)小于1.5時(shí)，該光譜將被視為來(lái)自癌變組織，否則被視為來(lái)自健康組織。應(yīng)用留一交叉驗(yàn)證法(LOOCV)分別衡量?jī)蓚€(gè)PLS-DA分類模型的性能。選擇決定系數(shù)R-square(取值范圍0～1)和均方根誤差值RMSE以衡量穩(wěn)定性，決定系數(shù)越大且越接近1，同時(shí)其均方根誤差值越小，該模型的穩(wěn)定性越好。然后，將來(lái)自另外四個(gè)病人的總共66條光譜(其中健康對(duì)照組28條，癌變組38條)作為預(yù)測(cè)集，以比較兩個(gè)判別模型的預(yù)測(cè)效果。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜分析

圖2所示分別為健康和癌變?nèi)橄俳M織的原始HOF-ATR-FTIR光譜經(jīng)基線校正和十點(diǎn)平滑處理后得到的在1800～1000 cm-1范圍的光譜圖。發(fā)現(xiàn)兩條譜線的一些特征譜帶發(fā)生了位移或強(qiáng)度、線寬的變化。其中，癌變樣本中1740 cm-1(υC=O)[15]處峰強(qiáng)度明顯弱于健康樣本，表明其對(duì)應(yīng)的特征成分脂肪在發(fā)生癌變時(shí)發(fā)生了明顯損耗。與核酸相關(guān)的吸收帶[15]則自1100 cm-1紅移至1086 cm-1，表明核酸中磷酸基團(tuán)的氫鍵化程度增加。1162 cm-1吸收帶是糖類C-O伸縮振動(dòng)(υC-O)與蛋白質(zhì)中絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸R基團(tuán)中的C-OH振動(dòng)的重疊譜帶[15]，該譜帶相對(duì)強(qiáng)度變?nèi)?，意味著隨著癌細(xì)胞的分裂，大量的糖作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗；該譜帶同時(shí)發(fā)生藍(lán)移，則歸因于蛋白質(zhì)中的C-OH的相關(guān)氫鍵斷裂[13]，其結(jié)果可能誘發(fā)β-折疊含量的減少。另一方面，癌變?nèi)橄俳M織在蛋白相關(guān)特征帶1636 cm-1雖然沒(méi)有發(fā)生明顯的位移[15]，但是吸收強(qiáng)度和帶形相比于健康乳腺組織卻發(fā)生了明顯變化。詳細(xì)的光譜與特征成分變化分析可見(jiàn)作者的最新工作[16]。這些結(jié)果表明，脂肪、核酸和蛋白等主要生物成分的變化是組織癌變最重要的光譜學(xué)特征。其中，由于酰胺I帶1636 cm-1富含蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息[9]，因此本文主要針對(duì)酰胺I帶進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化研究。

圖2 健康和癌變?nèi)橄俳M織的典型HOF-ATR-FTIR光譜(1800-1000 cm-1)

圖3分別是健康組織和癌變組織在1700-1600 cm-1的典型原始譜圖(a)、二階導(dǎo)數(shù)譜(b)和傅里葉去卷積譜(c)，由圖可知，酰胺I帶應(yīng)由多個(gè)子峰組成。無(wú)論是健康組織還是癌變組織，其二階導(dǎo)數(shù)譜和傅里葉去卷積譜幾乎對(duì)稱，二階導(dǎo)數(shù)譜的極小值和和傅里葉去卷積譜的極大值波數(shù)位置基本一致，具有“對(duì)稱相似性”。

圖3 健康(a)和癌變(b)乳腺組織的酰胺I帶(1700-1600 cm-1)的典型原始譜圖(a)、二階導(dǎo)數(shù)譜(b)和傅里葉變換去卷積譜(c)

結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)譜和去卷積譜對(duì)樣本的紅外光譜酰胺I帶進(jìn)行擬合與分峰，圖4列出乳腺組織酰胺I帶的典型原始譜圖(a)、各擬合子譜(b)和擬合計(jì)算譜(c)，每個(gè)光譜擬合的殘差(Residuals)均小于0.005，且擬合后曲線與原始數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)(R-square)均大于0.99(越接近1表示其擬合效果越好)。對(duì)酰胺I帶的各子峰歸屬如下：1620～1640 cm-1可以認(rèn)為是β-折疊；1640～1650 cm-1被分配為無(wú)規(guī)卷曲；1650-1659 cm-1為α-螺旋；非典型螺旋結(jié)構(gòu)在1660-1669 cm-1，含三股螺旋、310螺旋和超螺旋等；1670-1700 cm-1則是β-轉(zhuǎn)角[17-19]。此外，1606 cm-1和1618 cm-1附近的子峰是側(cè)鏈振動(dòng)吸收形成的，不歸屬于β-折疊。

圖4 健康(a)和癌變(b)乳腺組織酰胺I帶的典型紅外光譜(a)、各擬合子譜(b)和擬合計(jì)算譜(c)

3.2 健康和癌變?nèi)橄俳M織酰胺I帶二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

擬合后計(jì)算的各二級(jí)結(jié)構(gòu)(β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲、α-螺旋、非典型螺旋和β-轉(zhuǎn)角)的含量平均值如圖5(A)所示?？砂l(fā)現(xiàn)，健康乳腺組織酰胺I帶二級(jí)結(jié)構(gòu)含量由大到小排列依次為β-折疊(0.415±0.013)、α-螺旋(0.207±0.010)、非典型螺旋(0.177±0.012)、無(wú)規(guī)卷曲(0.118±0.008)和β-轉(zhuǎn)角(0.082±0.020)；而癌變?nèi)橄俳M織中酰胺I帶二級(jí)結(jié)構(gòu)含量由大到小的順序?yàn)棣?折疊(0.372±0.011)、α-螺旋(0.227±0.006)、β-轉(zhuǎn)角(0.164±0.019)、非典型螺旋(0.151±0.007)和無(wú)規(guī)卷曲(0.087±0.010)。兩者的含量大小排列相近，最多的為β-折疊和α-螺旋，總含量超過(guò)百分之五十；不同在于無(wú)規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角和非典型螺旋有排列差異。

圖5 健康和癌變?nèi)橄俳M織的二級(jí)結(jié)構(gòu)平均含量(a)和平均含量比值(b)的對(duì)比

比較健康/癌變?nèi)橄俳M織中酰胺I帶各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，發(fā)現(xiàn)癌變?nèi)橄俳M織的β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲和非典型螺旋含量均低于健康乳腺組織，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量高于健康乳腺組織。

健康乳腺組織和癌變?nèi)橄俳M織的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量差異主要來(lái)自于組織中各類蛋白質(zhì)含量的差異性。乳腺組織包含實(shí)質(zhì)成分和結(jié)締組織為主的間質(zhì)成分，而結(jié)締組織主要成分包括以α-螺旋為主的α-角蛋白、以β-折疊結(jié)構(gòu)為主的絲心蛋白和以非典型螺旋為主的膠原蛋白。因此，非典型螺旋的減少預(yù)示著膠原蛋白的減少[20-21]。相對(duì)于健康組織，癌變?nèi)橄俳M織中非典型螺旋含量低于健康乳腺組織，表明癌變?nèi)橄俳M織中膠原蛋白的含量低于健康組織，這是由于受病變影響，癌變組織失去了健康結(jié)構(gòu)中所特有的纖維結(jié)構(gòu)。癌變時(shí)蛋白合成增加以及脂質(zhì)含量減少[16,22]，據(jù)此推測(cè)在膠原蛋白減少及β-折疊結(jié)構(gòu)為主的絲心蛋白也在減少的同時(shí)，所增加的蛋白合成應(yīng)主要是α-角蛋白。推測(cè)正是因?yàn)棣?角蛋白(堅(jiān)韌有彈性)的增加，從而導(dǎo)致異變的乳腺組織腫大硬結(jié)成瘤，同時(shí)絲心蛋白(決定其分子伸展)的減少則可能導(dǎo)致該部分組織甚至附屬的皮膚發(fā)生粘連褶皺等病理現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量比值也可以用來(lái)描述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成的差異性。由圖5(B)可見(jiàn)，相對(duì)于健康乳腺組織，癌變?nèi)橄俳M織的α-螺旋含量升高，β-折疊和非典型螺旋含量減少，所以其α-螺旋/β-折疊的含量比值相應(yīng)有明顯增長(zhǎng)，而非典型螺旋/α-螺旋比值減小。此外，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量都有升高，且β-轉(zhuǎn)角/α-螺旋比值增大，可以推測(cè)出在癌變過(guò)程中α-螺旋的增長(zhǎng)幅度小于β-轉(zhuǎn)角。通過(guò)比較得出，健康和癌變?nèi)橄俳M織中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量構(gòu)成有顯著的區(qū)別，從而可以用多種參數(shù)來(lái)表示蛋白質(zhì)的各二級(jí)結(jié)構(gòu)組成、變化強(qiáng)弱的具體差異。依據(jù)這些參數(shù)可進(jìn)一步原位區(qū)別健康和癌變?nèi)橄侔┙M織，理解其癌變過(guò)程。

3.3 PLS-DA

表1所示是訓(xùn)練組進(jìn)行PLS-DA的分類和交叉驗(yàn)證結(jié)果。當(dāng)選擇酰胺I帶建立判別模型時(shí)，訓(xùn)練組準(zhǔn)確率93.3%，交叉驗(yàn)證組準(zhǔn)確率89.3%，而采用全波長(zhǎng)光譜建立的判別模型訓(xùn)練組和交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確率都達(dá)到100%。另外，根據(jù)兩種模型的RMSE和R-square值判斷，采用全光譜建立的模型穩(wěn)定性更好。表2所示為預(yù)測(cè)組的PLS-DA分類結(jié)果。由表2可見(jiàn)，由酰胺I帶建立的判別模型識(shí)別準(zhǔn)確率只有81.8%，而采用全光譜建立的模型識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)到97.0%。此外，只采用酰胺I帶建立的模型出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率較大。

表1 訓(xùn)練組分類結(jié)果

表2 預(yù)測(cè)組分類結(jié)果

以上分類識(shí)別的結(jié)果表明，雖然酰胺I帶含有大量的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，但只選擇該波長(zhǎng)范圍建立判別模型的效果明顯低于采用全光譜的效果，這是由于癌變過(guò)程中不僅有蛋白質(zhì)的變化，還有其他主要生物成分如核酸、脂質(zhì)和碳水化合物的變化。因此，單獨(dú)依靠酰胺I帶的變化去分辨癌變和健康組織顯然是不充分和不全面的。采用全光譜綜合計(jì)量癌變過(guò)程中蛋白質(zhì)等多組分的變化才更可能實(shí)現(xiàn)精確判別癌變組織。

4 結(jié)論

采用HOF-ATR-FTIR光譜技術(shù)研究乳腺組織的蛋白質(zhì)(酰胺I帶)二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)癌變組織和健康組織的各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量和相應(yīng)比值有顯著差異。同時(shí)，隨著乳腺癌變時(shí)膠原蛋白和絲心蛋白的減少，α-角蛋白合成明顯增加，可能進(jìn)而引起癌變病理。雖然酰胺I帶包含大量蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，但單獨(dú)選擇該波長(zhǎng)范圍的光譜建立判別模型，其識(shí)別率及模型穩(wěn)定性都低于采用全波長(zhǎng)光譜建立的模型，這是由于癌變過(guò)程中還涉及其他主要生物成分如核酸、脂肪以及碳水化合物的變化。由此可見(jiàn)，對(duì)乳腺組織癌變的HOF-ATR-FTIR光譜研究不僅有助于深入理解乳腺組織發(fā)生癌變時(shí)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，也提供了一種從分子水平上分析乳腺組織癌變機(jī)理、原位檢測(cè)和精確識(shí)別乳腺癌變的有效方法。