努爾比亞木·麥麥提依明 吳 龍 趙 今

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙體牙髓科，新疆烏魯木齊 830000

牙髓是一種特殊的結(jié)締組織[1]。牙髓也會(huì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[2]。牙髓炎是影響牙髓組織的最常見(jiàn)的病理性疾病[3-4]。目前針對(duì)牙髓炎的診斷和治療具有一定的阻礙[5]。細(xì)菌感染是引起牙髓炎的主要原因[6]。牙髓防御系統(tǒng)中可以決定牙髓炎癥的程度[7]。細(xì)胞因子和趨化因子積聚可能促進(jìn)牙髓炎的進(jìn)展[8-9]。目前對(duì)牙髓炎的分子失調(diào)機(jī)制仍然沒(méi)有達(dá)成共識(shí)。本文從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的兩個(gè)基因表達(dá)譜中整合了牙髓炎與正常牙髓組織的差異表達(dá)基因。通過(guò)生物信息學(xué)的分析方法探究牙髓炎的關(guān)鍵失調(diào)基因和分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.NCBI.nlm.nih.gov/GEO/）收集牙髓炎數(shù)據(jù)集GSE77459（2016 年2 月）和GSE9 2681（2017 年12 月）。使用“l(fā)imma”R 包（version 3.40.6）進(jìn)行差異分析。設(shè)定閾值P ＜0.05 和log2FC>1 獲得差異表達(dá)基因（DEGs）。從蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）（version 11.0）篩選只包含差異基因的數(shù)據(jù)，設(shè)置得分為>500。利用Cytoscape 3.5.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得到基因的連接度（degree）。

1.2 富集分析和基因集富集分析（GSEA）

使用“cluster Profiler”R 包（version 3.12.0）進(jìn)行基因本體論（GO）分析。使用Cytoscape 3.5.1 分析京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路。通過(guò)Broad Institute（http：//software.broadinstitute.org/gsea/）進(jìn)行GSEA，篩選KEGG 信號(hào)通路。

1.3 樣本收集

各收集3 例牙髓炎及健康的牙髓組織。所有的樣本均獲得了患者的知情同意并獲得了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）

利用Trizol（Invitrogen）提取牙髓組織總RNA，并用PrimescriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄cDNA。通過(guò)SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物見(jiàn)表1。使用2-ΔΔCT的方法分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

1.5 Western blot（WB）

通過(guò)RIPA 裂解液提取牙髓組織總蛋白。采用凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h 后在4℃下孵育一抗過(guò)夜。沖洗后與二抗孵育2 h。通過(guò)化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore）觀察膜上的免疫反應(yīng)蛋白。β-actin 為內(nèi)參蛋白?？贵w均購(gòu)自Abcam 公司。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。主要抗體如下：PTPRC（Abcam）、CD86（Abcam）、CD44（Abcam）、ERK1/2（Abcam）、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204;Abcam）、β-actin（Abcam）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R 3.6.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用student t 檢驗(yàn)比較兩組之間的差異。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙髓炎組織中的差異表達(dá)基因

GSE77459 中牙髓炎和健康對(duì)照之間有1280 個(gè)DEGs（圖1A）。差異變化倍數(shù)最大的前10 個(gè)基因見(jiàn)表2。GSEA 結(jié)果顯示，牙髓炎組織中Toll 樣受體、MAPK、JAK-STAT 信號(hào)通路明顯升高（圖1B）。通過(guò)GSE92681 的DEGs 驗(yàn)證到81 個(gè)基因（圖1C）。它們可能是牙髓炎潛在的失調(diào)因子。

表2 GSE77459 中差異變化倍數(shù)較大的前10 個(gè)基因

2.2 生物功能和通路

GO 功能富集分析共識(shí)別了201 個(gè)生物學(xué)進(jìn)程（BP）（圖2A），42 個(gè)細(xì)胞成分（CC）（圖2B）和6 個(gè)分子功能（MF）（圖2C）。它們主要集中于T 細(xì)胞活化和ERK1/2 通路的正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控等生物過(guò)程。另外，獲得的11 個(gè)KEGG 信號(hào)通路則反映了牙髓炎的差異基因主要與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)（圖2D）。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與樞紐基因鑒定

潛在失調(diào)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)中包括55 個(gè)基因（圖3A）。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)的degree 鑒定了前3 個(gè)基因作為關(guān)鍵失調(diào)基因，包括PTPRC、CD86 和CD44。此外，它們?cè)趦商讛?shù)據(jù)中的表達(dá)方向一致（圖3B）。

2.4 關(guān)鍵基因及信號(hào)通路驗(yàn)證

通過(guò)qRT-PCR 和WB 驗(yàn)證了CD44 在牙髓炎組織中顯著表達(dá)上調(diào)（圖4A）。前文發(fā)現(xiàn)CD44 正向調(diào)控ERK1/2 通路。在牙髓炎中ERK1/2 通路被激活（圖4B）。因此，CD44 可能通過(guò)ERK1/2 途徑促進(jìn)牙髓炎的疾病進(jìn)程。

3 討論

牙髓對(duì)外部因素很敏感，如齲齒引起的微生物感染等刺激[10]。這些因素可能引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)，進(jìn)而通過(guò)神經(jīng)源性炎癥向疼痛方向發(fā)展[11]。因此，深入了解牙髓炎癥過(guò)程對(duì)發(fā)展牙科診斷治療是至關(guān)重要的。本研究對(duì)牙髓炎和對(duì)照的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，鑒定了在牙髓炎中具有重要作用的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路。

差異變化倍數(shù)最大的兩個(gè)基因中，IGKV1-5 在牙髓炎組織中表達(dá)顯著上調(diào)。有研究顯示其在牙周炎組織中表達(dá)上調(diào)，是與炎癥和疼痛有關(guān)的分子[12-14]。顯著下調(diào)基因NR1D1 可以調(diào)控NLRP 3 炎癥小體的活性[15]，還與增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗細(xì)菌特性有關(guān)[16]。有81 個(gè)基因在兩套數(shù)據(jù)中同時(shí)差異表達(dá)。本研究認(rèn)為這些基因更有可能是牙髓炎過(guò)程中的失調(diào)基因。另一方面，從GSEA 和富集分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，牙髓炎相關(guān)的失調(diào)基因主要參與免疫炎癥相關(guān)的生物功能和信號(hào)通路。在牙髓感染的情況下，趨化白細(xì)胞使溶酶體酶增加，從而造成組織損傷[17]。Toll 樣受體4（TLR 4）通路參與大鼠急性牙髓炎所致傷害性感覺(jué)[18]。此外，TLR 4 的刺激還會(huì)引發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α和IL-1 的釋放[19-21]。

圖1 牙髓炎組織的差異表達(dá)基因

牙髓炎相關(guān)失調(diào)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因具有相互作用關(guān)系，可能在牙髓炎過(guò)程中具有協(xié)同作用。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心因子中，qRT-PCR 結(jié)果驗(yàn)證了CD44 的表達(dá)差異。CD44 是一種廣泛表達(dá)的黏附分子，已有研究報(bào)道其在牙髓炎組織中的表達(dá)顯著上調(diào)[22]。CD44 正向調(diào)控ERK1 和ERK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)炎癥具有促進(jìn)作用[23]。本研究識(shí)別了CD44 通過(guò)ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)牙髓炎的進(jìn)程。這一過(guò)程應(yīng)進(jìn)行深入研究，以了解其作為標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力和影響。

圖2 失調(diào)基因的富集結(jié)果

圖4 驗(yàn)證關(guān)鍵失調(diào)基因