史曉娜 徐 霞 謝閨娥

廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣東廣州 510182

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。其中三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是孕激素受體、雌激素受體和人表皮生長因子受體-2 都呈陰性表達的乳腺癌，復發(fā)率和遠處轉移率高，臨床預后較差[3]?；熕幬锸菍拱═NBC 在內(nèi)的乳腺癌的重要手段[4-5]，然而腫瘤耐藥性的產(chǎn)生嚴重影響治療效果[6-7]，因此，探索新型化療藥物已成為乳腺癌治療的一個重大課題。

雷公藤紅素又名南蛇藤素，分子式為C29H38O4，分子量為450.61，結構式如圖1 所示。雷公藤紅素有抗炎[8]、抗氧化[9]、免疫抑制[10]及抗腫瘤活性[11-13]等多種藥理活性。它能抑制多種腫瘤細胞的生長，但其對乳腺癌的作用及其機制尚未完全明確。本研究探索雷公藤紅素對生物學特性與TNBC 最接近的MDA-MB-231細胞[14]的抗腫瘤作用，以期為探索抗乳腺癌的化療新藥提供依據(jù)。

圖1 雷公藤紅素結構式

1 材料與方法

1.1 材料

人MDA-MB-231 乳腺癌細胞系來自美國模式培養(yǎng)物保藏所；雷公藤紅素（Sigma，批號：042M4608V）；TUNEL 試劑盒（Roche，批 號：39006700）、Annexin V細胞凋亡試劑盒（BD Pharmingen，批號：6301518）；p-AKT、AKT、Bcl-xL 及Survivin 抗體（Cell Signaling，貨號分別為9271、9272、2762、2803）。

酶標儀（Synerge-HTX，BioTek）；熒光顯微鏡（Cytation5，BioTek）；流式細胞儀（FACS Canto Ⅱ，Becton Dickinson）。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制 雷公藤紅素溶解于二甲基亞砜，配制成10 mmol/L 母液，-20℃避光貯存。

1.2.2 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231 于37℃、5% CO2培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 中。

1.2.3 MTT 比色 MTT 實驗方法參照本課題組前期研究論文中所述[15]。

1.2.4 Annexin V-FITC 熒光染色 實驗分為兩組：對照組和處理組。對照組未經(jīng)任何處理，處理組用2.0 μmol/L 雷公藤紅素作用后，消化細胞，洗滌重懸后，加入Annexin V-FITC 與碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育15 min 后在流式細胞儀上檢測凋亡情況。

1.2.5 TUNEL 染色 固定細胞并用Triton X-100 打孔，加rTdT 反應液37℃孵育1 h；再加PI 室溫避光孵育15 min；PBS 洗滌，干燥后用熒光顯微鏡進行觀察，綠色熒光信號為TUNEL 染色陽性。

1.2.6 免疫印跡法（Western blot）取30 μg 細胞總蛋白電泳后電轉印PVDF 膜，封閉后加1∶500 稀釋的一抗于4℃反應過夜，第2 天洗滌后，用1∶1000 稀釋的HRP 標記的二抗在室溫孵育1 h，ECL 法發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤紅素對MDA-MB-231 生長的影響

MTT 比色表明，雷公藤紅素能抑制MDA-MB-231的生長，其抑制作用呈濃度依賴性，作用48 h 后，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.93 μmol/L。見圖2。

圖2 雷公藤紅素對MDA-MB-231 的生長抑制曲線

2.2 雷公藤紅素對MDA-MB-231 凋亡的影響

Annexin V-FITC 染色結果顯示，處理組凋亡細胞比率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 Annexin V-FITC 熒光染色檢測雷公藤紅素對MDA-MB-231 的凋亡誘導作用

TUNEL 染色結果顯示，處理組TUNEL 陽性細胞比率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖4。

2.3 雷公藤紅素對Akt 信號通路的調(diào)節(jié)

Western blot 試驗表明，與對照組比較，處理組p-Akt、Survivin 和Bcl-xL 的蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；兩組Akt 總蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖5。

圖5 雷公藤紅素對MDA-MB-231 細胞Akt 信號通路的影響

3 討論

雷公藤紅素可抑制多種腫瘤的生長[11-13,16-18]，但其對乳腺癌的作用及其機制尚未完全明確。本研究提示雷公藤紅素能抑制MDA-MB-231 乳腺癌細胞的生長，作用48 h 的IC50為0.93 μmol/L。

乳腺癌的發(fā)生及其化療抵抗可能與細胞凋亡異常有關[19-21]。本研究中處理組凋亡細胞比率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），提示雷公藤紅素能誘導MDA-MB-231 細胞發(fā)生凋亡。

Akt 通路是調(diào)節(jié)細胞凋亡[22]和乳腺癌化療敏感性[23-25]的關鍵信號通路。本研究表明雷公藤紅素能抑制Akt 磷酸化。Survivin[26]和Bcl-xL[27]是Akt 下游的凋亡抑制分子。雷公藤紅素作用后，伴隨Akt 去磷酸化，Survivin 和Bcl-xL 的表達隨之降低。

本研究揭示了雷公藤紅素對MDA-MB-231 的生長抑制作用，但不足之處在于僅探討了這一種乳腺癌細胞系，沒有以正常乳腺上皮細胞系如MCF-10A 作為對照，也沒有陽性藥物對照，后續(xù)本課題組會繼續(xù)完善和深入雷公藤紅素抗乳腺癌作用研究，以期為探索抗乳腺癌新藥提供更充分的實驗依據(jù)。