郭 森， 張 碩， 付慧霄， 劉 偉， 李 靜， 朱 江， 張 弛

帕金森是一種臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動遲緩、四肢震顫等[1,2]。老年人群為帕金森癥狀的高發(fā)群體，近年來，我國帕金森發(fā)病率居高不下[3,4]。帕金森癥狀發(fā)病機(jī)制相對較為復(fù)雜，目前臨床醫(yī)學(xué)尚未將帕金森發(fā)病機(jī)制研究透徹，因此尚無一種特效的治療帕金森的手段[5]。本文研究中設(shè)計動物實(shí)驗(yàn)，建立帕金森大鼠模型，使用姜黃素進(jìn)行干預(yù)，觀察效果。

1 材料與方法

1.1 材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由華蘭生物工程股份有限公司提供，年齡8～10月，平均(9.0±0.9)m；體重225～238 g，平均體重(231.8±5.2)g。在相對濕度50%～55%、溫度(23.9 ℃±2.5 ℃)的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w，光照12 h/d。主要試劑：兔抗小鼠IL-6、IL-1β抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠TNF-α抗體(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 隨機(jī)選取10只大鼠為正常組，不做處理。其余30只建立帕金森模型：將魚藤酮在葵花油乳油中溶解，濃度2 mg/ml，之后對大鼠進(jìn)行頸背部皮下注射，劑量2 mg/(kg·d)，1次/d，連續(xù)注射28 d。對大鼠行為學(xué)進(jìn)行觀察檢測，大鼠肢體僵直、震顫、步態(tài)不穩(wěn)、行動遲緩可視為建模成功。共建模成功28只，將28只帕金森模型大鼠隨機(jī)分為模型組10只以及低、高劑量組各9只。正常組、模型組大鼠使用生理鹽水進(jìn)行灌胃處理，低、高劑量組大鼠分別使用20 mg/kg、60 mg/kg姜黃素提取物溶液進(jìn)行灌胃處理，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.2 學(xué)習(xí)記憶能力檢測 準(zhǔn)備高50 cm、直徑150 cm圓形水池，并分別標(biāo)記4個點(diǎn)位，注入半池水，水溫27 ℃。準(zhǔn)備高30 cm、直徑10 cm平臺置于水池中央。分別于已標(biāo)記4點(diǎn)位處將大鼠置入水中，統(tǒng)計各組大鼠自入水點(diǎn)游至預(yù)置平臺時間，將120 s內(nèi)未游至平臺的大鼠引至平臺，潛伏期記為120 s。大鼠在平臺上停留30 s之后，將其置于其他不同入水點(diǎn)重新測試。所有大鼠均連續(xù)測試4 d，第5天撤除平臺，將大鼠自入水點(diǎn)放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺位置次數(shù)。

1.2.3 標(biāo)本制備、HE染色 取各組大鼠尾部靜脈血1 ml,2000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80 ℃環(huán)境中保存待檢。對各組大鼠進(jìn)行麻醉處理后，頸椎脫臼法處死，取大鼠腦組織，固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片。首先將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復(fù)水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察，并對神經(jīng)元大小、數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平 設(shè)置10個標(biāo)準(zhǔn)孔，設(shè)置1個空半空及若干待測樣品,在10 μl待測樣品中加入40 μl樣本稀釋液，封板膜封板，置于37 ℃水浴箱溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次，每次間隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶標(biāo)液50 μl，封膜溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次，每次間隔30 s，拍干，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光環(huán)境下顯色15 min，在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液50 μl/孔以終止反應(yīng)，450 nm波長測量每孔吸光度，檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織病理學(xué)觀察 與正常組比較，模型組大鼠腦組織細(xì)胞出現(xiàn)較為嚴(yán)重的腫脹、破裂狀況，細(xì)胞排列不規(guī)則；低劑量組、高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞腫脹、破裂狀況出現(xiàn)緩解，且高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞排列較規(guī)則，細(xì)胞腫脹、破裂狀況情況相對較輕(見圖1)。

2.2 各組大鼠神經(jīng)元大小、數(shù)量比較 與正常組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠神經(jīng)元大小、數(shù)量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組大鼠神經(jīng)元大小、數(shù)量較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組大鼠神經(jīng)元大小、數(shù)量較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.3 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 與正常組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠各時間點(diǎn)逃避潛伏期較長，穿越平臺次數(shù)較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、低劑量組組比較，高劑量組大鼠各時間點(diǎn)逃避潛伏期較短，穿越平臺次數(shù)較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

2.4 各組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、低劑量組比較，高劑量組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表1 各組大鼠神經(jīng)元大小、數(shù)量比較

表2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

表3 各組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

3 討 論

作為一種常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，帕金森發(fā)病后主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、步態(tài)、姿勢障礙、運(yùn)動障礙等[6,7]。目前臨床醫(yī)學(xué)尚未將帕金森的發(fā)病機(jī)制研究透徹，年齡因素、環(huán)境因素、家庭遺傳因素、氧化應(yīng)激反應(yīng)等均可能參與帕金森的發(fā)生發(fā)展[8,9]。藥物治療是臨床常用的治療帕金森的手段，有研究表示，抗精神疾病藥物多具有一定的藥物毒性，可能會對患者肝腎功能造成一定的損傷，治療安全性并不理想，因此越來越多的專家學(xué)者致力于中醫(yī)藥治療帕金森的研究[10,11]。作為一種由天南星科、姜科植物中提取出的多酚化合物，姜黃素具有消炎、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[12,13]，但是關(guān)于將姜黃素應(yīng)用于帕金森臨床治療的研究還相對較少。

帕金森癥狀的發(fā)生發(fā)展對機(jī)體認(rèn)知功能、神經(jīng)功能造成嚴(yán)重的影響。許多學(xué)者通過設(shè)計水迷宮動物實(shí)驗(yàn)對動物模型學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測。余恒[14]等在研究中建立帕金森大鼠模型，并設(shè)計水迷宮實(shí)驗(yàn)對學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測，得出有效的干預(yù)能夠改善帕金森大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用的結(jié)論。本研究中設(shè)計水迷宮實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，帕金森大鼠逃避潛伏期較長，穿越平臺次數(shù)少，說明帕金森癥狀的發(fā)生發(fā)展會對大鼠神經(jīng)功能造成較大損傷，嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)記憶能力。使用高劑量姜黃素進(jìn)行干預(yù)的帕金森大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數(shù)增加，說明使用高劑量姜黃素進(jìn)行干預(yù)能夠減輕帕金森大鼠神經(jīng)損傷程度，使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提升，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。本文研究中還對帕金森大鼠腦組織神經(jīng)元大小、數(shù)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，使用高劑量姜黃素進(jìn)行干預(yù)的帕金森大鼠腦組織神經(jīng)元大小、數(shù)量均明顯上升，說明姜黃素能夠改善帕金森大鼠神經(jīng)元大小、數(shù)量，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

帕金森癥狀的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體腦組織炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[15～17]。IL-6、IL-1β、TNF-α均為TLR4/NF-κB信號通路的下游因子，TLR4/NF-κB信號通路在機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此IL-6、IL-1β、TNF-α在機(jī)體炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。本文研究結(jié)果顯示，使用高劑量姜黃素對帕金森模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平出現(xiàn)明顯下降，說明使用高劑量姜黃素進(jìn)行干預(yù)，能夠減輕帕金森腦組織炎癥反應(yīng)，從而減輕神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，使用姜黃素對帕金森模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提升大鼠腦組織神經(jīng)元大小、數(shù)量，發(fā)揮神經(jīng)元損傷修復(fù)作用，其功能可能與減輕腦組織炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)，為帕金森的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

正常組 模型組 低劑量組 高劑量組