肖雷 李蘭蘭 唐華 劉雅麗

支氣管哮喘是目前影響兒童健康最常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，可發(fā)生于各年齡組，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)[1]。支氣管哮喘是一種由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的慢性非特異性炎癥，以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征，臨床癥狀有反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、氣急以及胸悶等[2]。哮喘的發(fā)病因素及發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，目前認(rèn)為T(mén)h1型細(xì)胞與Th2型細(xì)胞之間數(shù)量和功能的失衡可能是哮喘發(fā)生的主要發(fā)病機(jī)制[3]。MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼小RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶基因mRNA的3′-非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)。大量研究表明miR-218在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，引起人們關(guān)注[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-218在肺癌組織中呈低表達(dá)，miR-218可能通過(guò)抑制Robo1的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞侵襲遷移[5]。而多項(xiàng)研究表明miR-218在慢性阻塞性肺炎患者肺組織或循環(huán)體液中一致性下調(diào)，表明miR-218與呼吸道疾病相關(guān)[6]。嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子3(eosinophil chemotactic factor-3,eotaxin-3)又稱(chēng)CCL26，是CC型趨化因子中的一員，可被Th細(xì)胞分泌，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的炎癥反應(yīng)調(diào)控分子，在過(guò)敏反應(yīng)及炎性反應(yīng)中具有重要作用[7]。有研究表明，在慢性鼻竇炎患者黏膜組織中eotaxin-3呈高表達(dá)，能夠啟動(dòng)炎癥因子的表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大[8]。miR-218與CCL26在兒童支氣管哮喘中的研究較少，本研究探究了miR-218與CCL26在支氣管哮喘急性期患兒血清中的表達(dá)及臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年6月至2019年6月本院收治的支氣管哮喘急性期患兒63例為觀察組，男37例，女26例，年齡2～12歲，平均年齡(5.68±3.96)歲；入院復(fù)查的哮喘緩解期患兒22例為對(duì)照組，男15例，女7例，年齡2～12歲，平均年齡(5.32±3.14)歲。根據(jù)《支氣管哮喘防治指南》[9]對(duì)哮喘急性期患兒病情嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)，哮喘急性期輕度發(fā)作患兒25例為輕度組，中度發(fā)作患兒20例為中度組，重度發(fā)作患兒18例為重度組。觀察組與對(duì)照組患者年齡、性別等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(兩組年齡比較t值為0.386、P值為0.701；兩組性別比較卡方值為0.613、P值為0.434)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組2008年修訂的支氣管哮喘診治指南標(biāo)準(zhǔn)[9]；②年齡<14歲；③所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①過(guò)敏性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫系統(tǒng)疾病患兒；②近一個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)呼吸道感染者；③近三個(gè)月內(nèi)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要試劑與儀器

Trizol試劑(上海信帆生物科技有限公司，批號(hào)XF-P2960)、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622，F(xiàn)ermentas，MA，USA)、PCR試劑盒(Thermo Fisher)、引物(上海捷瑞公司合成)、人血清CCL26 酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司，貨號(hào)：WK-SU00052)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)ELISA試劑盒(上海群己生物有限公司，貨號(hào)：KA3943)、IL-17、IgE ELISA試劑盒(上海歌凡生物科技有限公司，貨號(hào)：HI029、HI079)；-80℃超低溫冰箱(北京德馨永嘉科技有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Roche公司，型號(hào)LightCycler 480 Ⅱ)。

三、研究方法

(1)樣本的采集與保存

所有受試者于住院第二日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心15 min后分離血清，置于-80℃冰箱保存待測(cè)。

(2)qRT-PCR法檢測(cè)血清miR-218水平

用Trizol法提取血清中總RNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海捷瑞公司設(shè)計(jì)合成，引物序列(見(jiàn)表1)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，63℃退火25 s，72℃延伸10 s，共進(jìn)行42個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以U6作為內(nèi)參，計(jì)算miR-218相對(duì)表達(dá)量(見(jiàn)表1)。

表1 引物序列

(3)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清CCL26水平

采用上海瓦蘭生物科技有限公司生產(chǎn)的CCL26 ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣、加酶標(biāo)抗體、溫育、洗滌、顯色、終止，測(cè)定受試者血清中CCL26的濃度3次，取平均值。

(4)觀察指標(biāo)

采用IL-10、IL-13、IL-17、IgE試劑盒，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定受試者血清中IL-10、IL-13、IL-17、IgE濃度。

采用肺功能檢測(cè)儀(德國(guó)JAEGER公司，型號(hào)：Master Scope Diffusion)對(duì)受試者肺功能進(jìn)行檢測(cè)，得到1s用力呼氣量(FEV1)及呼氣峰流速(PEF)，指標(biāo)以實(shí)測(cè)值占預(yù)計(jì)值百分比表示。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、兩組患兒血清miR-218、CCL26表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，觀察組患兒血清中miR-218水平顯著降低(P<0.05)；血清CCL26水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 兩組miR-218、CCL26表達(dá)水平比較

二、兩組患兒血清中相關(guān)炎性因子水平比較

與對(duì)照組相比，觀察組患兒IL-13、IL-17、IgE表達(dá)顯著升高(P<0.05)；FEV1、PEF水平顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 兩組患兒血清中相關(guān)炎性因子水平比較

三、不同嚴(yán)重程度患兒血清中miR-218、CCL26表達(dá)水平比較

與輕度組相比，中度組、重度組患兒血清miR-218水平顯著降低，CCL26水平顯著升高(P<0.05)；與中度組相比，重度組患兒血清miR-218水平顯著降低，CCL26水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 不同嚴(yán)重程度患兒血清中miR-218、CCL26表達(dá)水平比較

四、血清miR-218、CCL26表達(dá)水平相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，miR-218與CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈負(fù)相關(guān)(r=-0.614、-0.610、-0.678、-0.498，P<0.05)，與FEV1、PEF呈正相關(guān)(r=0.680、0.643，P<0.05)；CCL26與FEV1、PEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.659、-0.714，P<0.05)，與IL-13、IL-17、IgE呈正相關(guān)(r=0.529、0.635、0.522，P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 血清miR-218、CCL26水平與炎癥因子相關(guān)關(guān)系

討 論

支氣管哮喘是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的慢性疾病，近年來(lái)，隨著環(huán)境污染日益嚴(yán)重，支氣管哮喘的患病率和死亡率快速增加[10]。目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，可能的發(fā)病機(jī)制有免疫學(xué)機(jī)制、遺傳學(xué)和環(huán)境因素、神經(jīng)受體調(diào)節(jié)機(jī)制、呼吸道感染等[11]。既往學(xué)者認(rèn)為T(mén)h1/Th2細(xì)胞功能失調(diào)是支氣管哮喘的主要發(fā)病機(jī)制，免疫功能下降，外源性致敏原被抗原遞呈細(xì)胞吞噬并激活T細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎性因子及多種活性物質(zhì)，導(dǎo)致氣道平滑肌收縮劑，氣道壁細(xì)胞分泌物增多，引發(fā)臨床癥狀，免疫功能下降亦可活化輔助性Th2細(xì)胞，激活免疫細(xì)胞聚集，吞噬炎性細(xì)胞，同時(shí)釋放出多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子等[12]。

miR-218由miR-218-1和miR-218-2兩基因編碼，分別位于染色體4p15.2及5q34-35[13]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-218靶基因主要富集在生物學(xué)調(diào)控、蛋白代謝、細(xì)胞遷移和黏附、細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程，以及蛋白結(jié)合、連接酶活性等分子功能中[14]。miR-218在子宮頸癌和頭頸部腫瘤中的研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-218后LAMB3表達(dá)下降，通過(guò)siRNA抑制LAMB3表達(dá)，細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移能力受到抑制[15]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-218在急性淋巴白血病T淋巴細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)KIT蛋白的表達(dá)，并抑制急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡[16]。miR-218在支氣管哮喘中的研究較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與支氣管哮喘緩解期患兒相比，急性期患兒血清中miR-218水平顯著降低，提示miR-218可能與支氣管哮喘急性期有關(guān)。且隨急性期患兒病情嚴(yán)重程度的增加，血清miR-218表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)，提示血清miR-218與支氣管哮喘急性期發(fā)病的過(guò)程相關(guān)。

CCL26位于23染色體上的7q11.含有3個(gè)外顯子，由77個(gè)氨基酸構(gòu)成，可與CCR3受體結(jié)合[17]。目前認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)是哮喘氣道炎癥發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞，而有研究表明，在體外CCL26對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化作用[18]。CC趨化因子不僅局部趨化作用，免疫調(diào)節(jié)、抗病毒免疫、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，同時(shí)還能夠促進(jìn)釋放組胺參與過(guò)敏反應(yīng)[19]。已有研究表明，哮喘患者支氣管黏膜中CCL26表達(dá)明顯增高，而在患者血清中的表達(dá)少有研究。本研究結(jié)果顯示，CCL26在支氣管哮喘急性期患兒血清中呈高表達(dá)，提示CCL26與支氣管哮喘急性期的發(fā)病有關(guān)。且隨支氣管哮喘急性期患兒病情嚴(yán)重程度的增加，CCL26水平呈逐漸升高趨勢(shì)，提示血清CCL26與支氣管哮喘急性期的病情發(fā)展有關(guān)，能夠一定程度反應(yīng)患兒病情嚴(yán)重程度。另對(duì)患兒血清中炎癥因子及肺功能進(jìn)行檢測(cè)，IL-13、IL-17是細(xì)胞免疫中的重要細(xì)胞因子，IgE屬于IL13下游因子，屬于Th2型細(xì)胞因子，且與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系密切；FEV1和PEF是評(píng)價(jià)支氣管哮喘嚴(yán)重程度和療效的重要指標(biāo)，可以反映患者的氣流受限程度，支氣管哮喘發(fā)作時(shí)其水平降低，與支氣管哮喘嚴(yán)重程度具有良好的正相關(guān)性[20]。結(jié)果顯示，支氣管哮喘急性期患兒血清中炎性因子IL-13、IL-17、IgE呈高表達(dá)，肺功能FEV1、PEF顯著低于緩解期患兒。提示血清中炎性因子過(guò)表達(dá)與支氣管哮喘急性期發(fā)病有緊密聯(lián)系，急性期患兒炎癥反應(yīng)顯著高于緩解期患兒；急性期患兒肺功能顯著下降，支氣管哮喘發(fā)作對(duì)患兒肺功能影響顯著。而相關(guān)性分析顯示，血清miR-218與CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈負(fù)相關(guān)，與FEV1、PEF呈正相關(guān)；CCL26與FEV1、PEF呈負(fù)相關(guān)，與IL-13、IL-17、IgE呈正相關(guān)。提示血清miR-218可能通過(guò)介導(dǎo)炎性反應(yīng)，影響支氣管哮喘患兒肺功能及病情嚴(yán)重程度；CCL26可能在嗜酸性粒細(xì)胞的黏附、募集和脫顆粒中發(fā)揮重要作用[21]。

綜上所述，在支氣管哮喘急性期患兒血清中miR-218呈低表達(dá)，CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈高表達(dá)。支氣管哮喘急性期患兒FEV1、PEF水平顯著低于緩解期患兒。