李德龍，何 韜，陳冰婷，伊麗則熱·艾拜杜拉，馬曉麗

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011

桑科(Moraceae)桑屬植物桑(MorusalbaL.)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，其葉子、果實(shí)、枝均可入藥，桑葉(Folium Mori，F(xiàn)oM)，性味苦甘寒，歸肺肝經(jīng)，功效：疏風(fēng)清熱，養(yǎng)肺明目，臨床上常應(yīng)用于心腦血管病或脫發(fā)的治療[2]；桑椹(Fructus Mori，F(xiàn)rM)，性味甘寒，歸心腎經(jīng)，補(bǔ)陰補(bǔ)血，生津潤(rùn)腸[3]，被稱(chēng)為“民間圣果”；桑枝(Ramulus Mori，RaM)，性味，苦平，歸肝，功效：祛風(fēng)清熱通絡(luò)，常用于關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕的治療[4]。從性味歸經(jīng)來(lái)看，桑葉作用更加廣泛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑的不同入藥部位中雖然都含有黃酮、生物堿、多酚等功效組分，具有抗氧化、抗炎、降脂、降糖、抗癌、降壓等作用[5]，但各入藥部位的活性成分含量、藥理活性及臨床用途并不完全相同。如何客觀闡明桑各入藥部位活性成分群、預(yù)測(cè)生物學(xué)機(jī)制成為了推動(dòng)桑資源基礎(chǔ)物質(zhì)研究的關(guān)鍵問(wèn)題。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種嚴(yán)重的代謝性疾病，對(duì)其有治療作用的中藥開(kāi)發(fā)一直是當(dāng)今的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于大數(shù)據(jù)分析的多元方法，能夠快速預(yù)測(cè)中藥的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，解釋中藥多成分起效的活性物質(zhì)群，對(duì)評(píng)價(jià)中藥的藥用價(jià)值具有重要作用[6]。Liu等[7]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)甘草苷主要通過(guò)調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路發(fā)揮治療抑郁癥和糖尿病的作用。Ge等[8]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究了桑葉粉末抗糖尿病的作用機(jī)制，鑒定并得到22種藥物成分，可調(diào)節(jié)TNF、PPARG、GSK3B、IRS1、IL-6等靶蛋白，它們與胰島素及炎癥信號(hào)通路、糖代謝等相關(guān)通路、慢性炎癥性疾病等有關(guān)。本課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了桑椹多成分協(xié)同防治防治糖尿病的作用機(jī)制[9]。

為進(jìn)一步明確桑不同入藥部位的抗糖尿病作用，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，系統(tǒng)分析各入藥部位藥性差異及作用機(jī)制，對(duì)比、解釋桑不同部位防治糖尿病的關(guān)鍵藥效物質(zhì)，結(jié)合生物信息注釋方法對(duì)藥性差異進(jìn)行全新闡釋?zhuān)瑸轱@著提升桑的藥用資源開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，促進(jìn)桑資源對(duì)復(fù)雜代謝性疾病防治提供全新的研究模式。

1 材料與方法

1.1 桑不同部位活性成分群及其潛在靶點(diǎn)的建立

通過(guò)TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM等中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中藥名稱(chēng)檢索及萬(wàn)方、知網(wǎng)文獻(xiàn)檢索獲取桑葉、桑椹、桑枝的化合物成分信息及化合物對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)信息。參考TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中口服生物利用度[10](oral bioavailability，OB≥30%)和類(lèi)藥性(drug-like，DL≥0.18)等中藥體內(nèi)ADME參數(shù)對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，并將篩選后的活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)名用Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，最終得到三個(gè)部位活性成分群及其潛在靶點(diǎn)。

1.2 桑不同部位活性成分-DM靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在OMIM、TTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“type 2 diabetes”為檢索詞，整合得到II型糖尿病靶點(diǎn)信息，與成分靶點(diǎn)取交集，得到不同部位治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.2軟件分別繪制桑不同部位活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 篩選桑不同入藥部位的主要活性成分及其差異分析

通過(guò)不同入藥部位活性成分-疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)篩選主要活性成分，將度值靠前的成分作為各入藥部位主要活性成分，并比較其共有成分與差異成分，判斷其藥性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

為了獲取與疾病有關(guān)的核心基因，我們分別將獲得的三個(gè)入藥部位的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，選取combined score>0.7的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，將結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO分類(lèi)富集分析與通路分析

將獲得的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入到WebGestalt(www.webgestalt.org/#)基因富集分析在線工具中進(jìn)行多組間GO注釋分析與KEGG通路富集分析(FDR<0.05)，比較并分析三個(gè)組織部位對(duì)2型糖尿病的作用機(jī)制。

1.6 分子對(duì)接

應(yīng)用AutoDock vina 軟件將三個(gè)部位PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3的5個(gè)靶點(diǎn)分別與3個(gè)共有成分、8個(gè)度值靠前的差異化合物進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，并用臨床常用藥物二甲雙胍(metformin)作為對(duì)照。分別從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載受體的晶體結(jié)構(gòu)和配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG對(duì)應(yīng)的PDB ID分別為3PZE、6S9W、4KZN、1ALU、6MS7，采用AutoDock Tools工具對(duì)上述蛋白受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理，再用其Autogrid模塊得到對(duì)接活性位點(diǎn)，運(yùn)行程序進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能 (affinity)。本研究以結(jié)合能< -5.0 kcal/mol為分子與靶點(diǎn)結(jié)合性較好的條件。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選及疾病靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)并剔除掉沒(méi)有明顯藥效的化合物后得到FoM中194個(gè)化合物，F(xiàn)rM中72個(gè)化合物，RaM中30個(gè)化合物，主要分為黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、揮發(fā)油、生物堿以及氨基酸類(lèi)等，對(duì)三者作韋恩圖比較(圖1A)，只有5種共有化合物桑黃酮(kuwanon c)、1-脫氧野尻霉素(DNJ)、桑色素(morin)、東莨菪內(nèi)酯(scopoletin)、肌肉肌醇(myo-inositol)，三個(gè)入藥部位化合物種類(lèi)差異明顯。根據(jù)OB及DL參數(shù)篩選并刪除一些一物多名的化合物與重復(fù)重現(xiàn)的靶標(biāo)以及一些沒(méi)有明確對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的化合物后，F(xiàn)oM有45個(gè)活性化合物和232個(gè)化合物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，F(xiàn)rM中有29個(gè)活性化合物和350個(gè)化合物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，RaM中有16個(gè)活性化合物和153個(gè)化合物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，這表明化合物與靶點(diǎn)的差異可能是桑不同入藥部位作用差異的原因。在OMIM、TTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到II型糖尿病靶點(diǎn)284個(gè)，與不同入藥部位活性成分作用靶點(diǎn)取交集(圖1B)，得到FoM治療靶點(diǎn)24個(gè)(PTGS2、PTGS1、PPARG、F2、DPP4等)，F(xiàn)rM治療靶點(diǎn)31個(gè)(PPARG、PTGS2、PTGS1、NFKB1、TP53等)，RaM治療靶點(diǎn)22個(gè)(PTGS2、PTGS1、MGAM、DPP4、F2等)，三者共有的治療靶點(diǎn)13個(gè)(MGAM、PIK3CG、DPP4、PPARG、TP53等)。

圖1 三個(gè)入藥部位整體化合物Venn圖(A)與ADME篩選后化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)Venn圖(B)Fig.1 Venn’s diagram of all compounds (A) and compound target-disease target after ADME screening (B) in three parts of M.alba

2.2 桑不同部位活性成分-DM靶標(biāo)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將三個(gè)入藥部位的活性化合物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)映射后作活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2～4)，F(xiàn)oM生成62個(gè)節(jié)點(diǎn)，136條邊；FrM生成46個(gè)節(jié)點(diǎn)，57條邊；RaM生成37個(gè)節(jié)點(diǎn)，65條邊，節(jié)點(diǎn)大小和顏色表示該節(jié)點(diǎn)自由度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，由綠色變紅色對(duì)應(yīng)的度值越大。其中FoM中度值較大的成分及度值為槲皮素(quercetin，16)、山奈酚(kaempferol，15)、甲基丁香酚(mthyleugenol，5)、丁香酚(eugenol，5)等，度值較大的靶點(diǎn)及度值為環(huán)氧合酶2(PTGS2，31)、環(huán)氧合酶1(PTGS1，24)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，15)、凝血酶原(F2，13)等；FrM中度值較大的成分及度值為槲皮素(quercetin，14)、反式白藜蘆醇(trans resveratrol，9)、甲酸(FMT，6)、楊梅素(myricetin，5)等，度值較大的靶點(diǎn)及度值為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，6)、環(huán)氧合酶2(PTGS2，5)、環(huán)氧合酶1(PTGS1，4)、DNA結(jié)合因子KBF1(NFKB1，3)等；RaM中度值較大的成分及度值為有山奈酚(kaempferol，15)、苦來(lái)西堿(cularicine，9)、桑色素(morin，6)、二氫山奈酚(dihydokaempferol，6)等，度值較大的靶點(diǎn)及度值為環(huán)氧合酶2(PTGS2，10)、環(huán)氧合酶1(PTGS1，9)、麥芽糖淀粉酶(MGAM，8)、二肽酰肽酶IV(DPP4，8)等，這些化合物和靶點(diǎn)可能是桑源藥材干預(yù)糖尿病的主要化合物與靶點(diǎn)。三者13種共有靶點(diǎn)中PTGS1、PTGS2、PPARG、F2、DPP4均度值靠前，但是PIK3CG只在FoM中度值靠前，TP53只在FrM中度值靠前，MGAM只在RaM中度值靠前；另外，F(xiàn)oM中沒(méi)有獨(dú)有靶點(diǎn)，F(xiàn)rM中13種獨(dú)有靶點(diǎn)中NFKB1度值靠前，RaM中3種獨(dú)有靶點(diǎn)中沒(méi)有度值靠前的靶點(diǎn)。這些主要化合物與靶點(diǎn)的差異也進(jìn)一步提示不同入藥部位防治糖尿病作用機(jī)制的不同。

圖2 FoM化合物-DM疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network of FoM ingredients-disease target

2.3 篩選桑不同入藥部位的主要活性成分及其差異分析

將各部位成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中的化合物進(jìn)行整理，得到FoM中有38個(gè)成分，F(xiàn)rM中有15個(gè)成分；RaM中有15個(gè)成分，將三部位成分進(jìn)行韋恩分析，見(jiàn)表1，并結(jié)合各部位成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析其度值，發(fā)現(xiàn)三部位中共有的主要成分有3個(gè)：桑色素、東莨菪內(nèi)酯、1-脫氧野尻霉素。桑色素是RaM中度值較高的成分；FoM中的特有成分有26個(gè)，其中丁香酚和甲基丁香酚是其度值較高的成分；FrM中的特有成分有6個(gè)，其中反式白藜蘆醇與楊梅素是其度值較大的成分；RaM中的特有成分有9個(gè)，其中苦來(lái)西堿與二氫山奈酚是其度值較大的成分。兩兩比較中，F(xiàn)oM與FrM共有成分為9個(gè)，槲皮素為兩者中高度值的成分，F(xiàn)oM與RaM共有成分為6個(gè)，其中山奈酚為兩者中高度值的成分。有趣的是FrM與RaM都有15個(gè)主要成分，但共有成分僅有3個(gè)常見(jiàn)成分，從三部位個(gè)差異成分的個(gè)數(shù)比較得出，F(xiàn)oM分別與FrM和RaM在防治糖尿病方面可能具有相似的作用，F(xiàn)rM與RaM在防治糖尿病方面可能作用的途徑差異較大。

圖3 FrM化合物-DM疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network of FrM ingredients-disease target

圖4 RaM化合物-DM疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network of RaM ingredients-disease target

表1 三個(gè)入藥部位活性成分差異Table 1 Different active components of three parts used in medicine

2.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中按照結(jié)合分?jǐn)?shù)(combined score)> 0.7篩選后的核心靶點(diǎn)相互作用關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中分別構(gòu)建三個(gè)部位PPI核心網(wǎng)絡(luò)(圖5)，邊越粗結(jié)合分?jǐn)?shù)越大，節(jié)點(diǎn)越大表明度值越大，F(xiàn)oM中共有22個(gè)節(jié)點(diǎn)，74條邊，其中胰島素(INS，14)、促分裂原活化蛋白激酶8(MAPK8，12)、α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，12)靶點(diǎn)度值排名靠前；FrM中共有26個(gè)節(jié)點(diǎn)，80條邊，其中

圖5 三部位PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network of three parts注：A：FoM；B：FrM；C：RaM。

胰島素(INS，14)、α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，14)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA，13)靶點(diǎn)度值排名靠前；RaM中共有16個(gè)節(jié)點(diǎn)，40條邊，其中度值排名靠前的靶點(diǎn)有白細(xì)胞介素-6(IL6，9)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，8)、α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，8)。三個(gè)入藥部位共涉及32個(gè)核心靶點(diǎn)，這些度值排名靠前的靶點(diǎn)可能是與糖尿病有關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖6 三個(gè)入藥部位GO富集分析柱狀圖Fig.6 Column diagram of go enrichment analysis in three parts注：A：FoM；B：FrM；C：RaM。

2.5 GO分類(lèi)富集分析與通路分析

2.5.1 GO富集分析

將獲得的三個(gè)部位的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入WebGestalt在線工具中進(jìn)行GO分析(FDR<0.05)：生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)。發(fā)現(xiàn)FoM中與BP相關(guān)的條目有細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的反應(yīng)等993條；CC相關(guān)條目有膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞表面等13條；MF相關(guān)條目有信號(hào)受體結(jié)合、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等33條。FrM中與BP相關(guān)條目有細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、凋亡過(guò)程調(diào)控、轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控、急性炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)等983條；CC相關(guān)條目有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、分泌顆粒、分泌囊泡等8條；MF相關(guān)條目有相同蛋白結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚活性、脂肪酸結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等66條。RaM中與BP相關(guān)條目有活性氧代謝過(guò)程的正調(diào)節(jié)、急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)含氧化合物反應(yīng)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、對(duì)有機(jī)氮化合物反應(yīng)、細(xì)胞增殖等886條；CC相關(guān)條目有膜微域、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等12條；MF相關(guān)條目有信號(hào)受體結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸酶結(jié)合、受體配體活性、抗氧化活性等36條。將本體條目按注釋到的基因數(shù)目進(jìn)行功能分類(lèi)做柱狀圖(圖7A～C)，可以看到涉及多個(gè)生物過(guò)程，其中所有靶點(diǎn)都與代謝過(guò)程有關(guān)，而糖尿病又是代謝紊亂的疾病，桑的三個(gè)入藥部位有可能主要干預(yù)代謝過(guò)程發(fā)揮治療糖尿病的作用，對(duì)三者BP進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)其都涉及細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，三者中尤以桑葉靶點(diǎn)功能最多(993條)，桑椹其次(983條)，桑枝最少(886條)，此結(jié)果可能表明調(diào)節(jié)代謝過(guò)程能力：桑葉>桑椹>桑枝。

圖7 分子對(duì)接的3D和2D模式圖Fig.1 3D and 2D pattern diagrams of molecular docking注：A：苦來(lái)西堿-MAPK8；B：苦來(lái)西堿-AKT1；C：二氫山奈酚-VEGFA；D：苦來(lái)西堿-IL6；E：槲皮素-PPARG。Note:A:Cularicine-MAPK8;B:Cularicine-AKT1;C:Dihydrokaempferol-VEGFA;D:Cularicine-IL6;E:quercetin-PPARG.

2.5.2 通路分析

利用WebGestalt在線工具對(duì)三個(gè)入藥部位治療DM的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析(FDR<0.05)，F(xiàn)oM靶點(diǎn)有83條通路，F(xiàn)rM有80條，RaM有93條。分別選取FDR值排名前20的通路，見(jiàn)表2～4，通路富集分析結(jié)果表明三個(gè)入藥部位的作用通路主要涉及疾病通路、炎癥與免疫相關(guān)通路等。FoM中與疾病有關(guān)的通路有胰島素抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、II型糖尿病、胰島素信號(hào)通路癌癥等；炎癥與免疫相關(guān)通路主要有脂肪細(xì)胞脂肪分解的調(diào)節(jié)、C型凝集素受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。FrM中與疾病有關(guān)的通路有流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥、胰島素抵抗；免疫與炎癥相關(guān)通路有脂肪細(xì)胞脂肪分解的調(diào)節(jié)、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路等。RaM中與疾病有關(guān)的通路有胰島素抵抗、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、II型糖尿病、胰島素信號(hào)通路、乙肝等；免疫與炎癥相關(guān)通路有C型凝集素受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。三個(gè)入藥部位通路富集分析都有糖尿病及其并發(fā)癥通路與大量的炎癥通路，可以看出糖尿病與炎癥具有密不可分的關(guān)系[11]。

表2 FoM治療靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Table 2 Enrichment analysis of KEGG pathway in FoM therapy target

續(xù)表2(Continued Tab.2)

表3 FrM治療靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Table 3 Enrichment analysis of KEGG pathway in FrM therapy target

表4 RaM治療靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Table 4 Enrichment analysis of KEGG pathway in RaM therapy target

續(xù)表4(Continued Tab.4)

2.6 分子對(duì)接

將三個(gè)部位PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3的5個(gè)靶點(diǎn)蛋白MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG分別與metformin、3個(gè)共有成分(A)和度值靠前的8個(gè)差異化合物(B)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表5。若結(jié)合能<0，表明配體分子均能和受體蛋白能自發(fā)地結(jié)合，結(jié)合能<-5.0 kcal/mol，表明其結(jié)合良好，結(jié)合能越小結(jié)合性越好。表中70%成分能與靶點(diǎn)蛋白較好地結(jié)合，且90%的成分結(jié)合性均好于對(duì)照藥。與5個(gè)靶點(diǎn)最佳的分子對(duì)接如圖8，其中苦來(lái)西堿與AKT1結(jié)合最好為-10.9 kcal/mol，苦來(lái)西堿(cularicine)與AKT1活性位點(diǎn)氨基酸殘基ASP292是形成π-陰離子相互作用、與 TRP80形成π-π堆積作用等非鍵相互作用。結(jié)果表明，這12 種成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合性能較好。

表5 三部位差異化合物與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Table 5 Results of molecular docking between differentially active compounds and target proteins

3 討論

糖尿病是一種發(fā)病率高，危害性大的代謝性疾病，有研究表明[11]糖尿病的發(fā)生發(fā)展與炎癥具有密切的關(guān)系，本研究也發(fā)現(xiàn)桑治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)VEGFA、IL6、MAPK8、TNF、TP53等與炎癥通路有關(guān)。

桑葉，性味苦甘寒，歸肺肝經(jīng)[2]；桑椹，性味甘寒，歸心腎經(jīng)[3]；桑枝，性味，苦平，歸肝[4]。從桑各部位性味歸經(jīng)來(lái)看，桑葉作用更加廣泛，桑椹與與桑枝作用差異較大。通過(guò)化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)表明桑的不同入藥部位防治糖尿病的化合物種類(lèi)及其作用靶點(diǎn)具有明顯差異，從三部位差異化合物的個(gè)數(shù)比較得出，F(xiàn)oM分別與FrM和RaM在防治糖尿病方面可能具有相似的作用，F(xiàn)rM與RaM在防治糖尿病方面可能作用的途徑差異較大，這與各部位性味歸經(jīng)相符。三個(gè)入藥部位中桑色素、東莨菪內(nèi)酯、1-脫氧野尻霉素3種為共有化合物，丁香酚、甲基丁香酚、反式白藜蘆醇、楊梅素、苦來(lái)西堿、二氫山奈酚、槲皮素、山奈酚8種為度值靠前的差異化合物。有研究表明[12]桑色素是一種PTP1B的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能起到胰島素增敏的作用，還能通過(guò)抗氧化與抗炎作用對(duì)胰島細(xì)胞起保護(hù)作用[13]；東莨菪內(nèi)酯是一種天然植物抗毒素，Jang等[14]發(fā)現(xiàn)東莨菪內(nèi)酯通過(guò)激活3T3-L1脂肪細(xì)胞的PI3K和AMPK途徑，促進(jìn)GLUT4易位到PM，從而促進(jìn)葡萄糖攝取，具有抗糖尿病作用。1-脫氧野尻霉素是從桑中發(fā)現(xiàn)的一種重要生物堿，對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并可以促進(jìn)糖酵解，抑制糖的異生，降低膽固醇合成，還能抑制胰島素的分泌，改善胰島素抵抗的作用[15]。甲基丁香酚是一種是丁香酚的衍生物，具有鎮(zhèn)痛抗炎與抗氧化應(yīng)激的作用[16]。反式白藜蘆醇能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的SIRT1和AMPK通路緩解胰島素抵抗，保護(hù)胰島B細(xì)胞功能[17]。楊梅素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌和鎮(zhèn)痛等藥理活性，它還具有抗糖尿病的作用，對(duì)人胰島淀粉樣多肽(HIAPP)誘導(dǎo)的胰腺β-細(xì)胞的細(xì)胞毒性和胰島功能的恢復(fù)有保護(hù)作用[18]。苦來(lái)西堿是RaM中特有成分，并且與AKT1、MAPK8、IL6分子對(duì)接得分較高，目前還未見(jiàn)報(bào)道其藥理作用，其對(duì)AKT1的高結(jié)合性有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。山奈酚通過(guò)抑制肝臟糖異生和提高肝臟胰島素敏感性來(lái)改善肥胖小鼠的高血糖[19]。桑的各部位的主要活性成分在改善糖尿病方面具有多種功效、為桑的不同部位防治糖尿病的活性成分群及其作用機(jī)制的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

PPI網(wǎng)絡(luò)中桑的三個(gè)部位按度值排名靠前的靶點(diǎn)有MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG。在分子對(duì)接中12種成分都能與這些靶點(diǎn)較好結(jié)合。VEGF是一種與肝素結(jié)合的同型二聚體蛋白，在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)血管生成和血管通透性，有研究表明[20]VEGFA的表達(dá)與糖尿病具有相關(guān)性。MAPK8是MAP激酶家族的成員。MAP激酶是多種生化信號(hào)的整合點(diǎn)參與，細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等多種過(guò)程。這種激酶被各種細(xì)胞刺激物激活，并針對(duì)特定的轉(zhuǎn)錄因子，從而介導(dǎo)細(xì)胞刺激后的早期基因表達(dá)。Guo等[21]采用Gene-ChipTM miRNA 4.0 Array篩選糖尿病人外周血血清發(fā)現(xiàn)MAPK8等7個(gè)基因可能與2型糖尿病胰島素抵抗有關(guān)。AKT1調(diào)控著許多過(guò)程，包括新陳代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成，并且AKT1基因多態(tài)性與代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[22]。IL6是一種重要的炎癥因子，參與多種免疫反應(yīng)，其在糖尿病病人中有顯著升高[23]。PPARG控制著脂肪酸的過(guò)氧化物酶體β氧化途徑，是脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量與2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[24]。這些結(jié)果與分子對(duì)接結(jié)果表明MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG這5個(gè)靶點(diǎn)可能是桑源藥材治療糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

從KEGG富集結(jié)果分析可知，桑的三種入藥部位主要從炎癥與免疫相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮治療糖尿病的作用，包括白介素-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)通過(guò)介導(dǎo)生長(zhǎng)因子信號(hào)在生物體生長(zhǎng)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝等方面起著重要作用，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，是調(diào)控血糖的主要信號(hào)通路，PI3K/Akt信號(hào)通路異常是糖尿病發(fā)生的重要原因[25]。IL-17是一種促炎性細(xì)胞因子。在糖尿病的發(fā)展中，p38MAPK與腎組織損傷密切相關(guān)。一方面，高血糖、血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激以及前炎癥因子等多種因素可以在上游誘導(dǎo)p38MAPK信號(hào)通路激活， 另一方面，活化的p38MAPK信號(hào)通路可以通過(guò)誘導(dǎo)下游炎癥細(xì)胞活化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)表達(dá)，干預(yù)細(xì)胞因子產(chǎn)生等途徑而導(dǎo)致腎組織炎癥性損傷[26]。研究結(jié)果表明，顯著富集的信號(hào)通路中也存在著部分調(diào)控其他疾病的通路，例如前列腺癌信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝信號(hào)通路、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路等。表明機(jī)體代謝是相互關(guān)聯(lián)的，藥?？梢酝ㄟ^(guò)作用于全身其他系統(tǒng)發(fā)揮間接治療糖尿病的作用。

總之，本研究首次應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思路與方法揭示了桑的不同入藥部位防治糖尿病的成分群及其作用機(jī)制，為研究同源異效的中藥資源提供了新的思路，為合理利用桑資源提供了理論參考。