侯 帆，鄧曉東，鐘燕嶺，張薇薇*

1成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610500；2四川國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，成都 610041

石斛(Dendrobium)為蘭科(Orchidaeae)的一大屬，是我國(guó)古文獻(xiàn)最早有記錄的蘭科植物之一，可追溯至1500年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》。石斛同靈芝、人參及冬蟲(chóng)夏草等珍貴藥材齊名，主傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞贏瘦，強(qiáng)陰，久服厚腸胃，輕身延年。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明石斛具有抗氧化、抗衰老、改善肝功能、治療白內(nèi)障、增強(qiáng)人體免疫力、降血糖、抗血栓、抗腫瘤、抗誘變、抗菌、促消化等功能[1]。目前，鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)、金釵石斛(D.nobileLindl.)、鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.)以及流蘇石斛(D.fimbriatumHook.)4種石斛被收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》中。此外，《中藥大辭典》中收載的石斛有9種，《新華本草綱要》中收錄的石斛多達(dá)21種。石斛藥理作用的發(fā)揮同其抗氧化活性相關(guān)，研究其抗氧化活性可為由氧化應(yīng)激引起的衰老、心血管疾病和癌癥等疾病的防治提供理論參考，因此石斛抗氧化活性研究成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，本文從具有抗氧化活性的石斛種、評(píng)價(jià)方法、有效成分及其作用機(jī)制三方面進(jìn)行綜述，以期為石斛抗氧化活性的后續(xù)研究提供最新參考與思路。

1 具有抗氧化活性的石斛種

石斛主要分布于東南亞的熱帶、亞熱帶以及大洋洲，種類達(dá)1 500余種，我國(guó)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的石斛種有76種(包含2個(gè)亞種)。統(tǒng)計(jì)可知，國(guó)內(nèi)外目前已報(bào)道具抗氧化活性的石斛有31種(見(jiàn)表1)，除黃心石斛外其余種均在我國(guó)境內(nèi)有分布。1996年就有報(bào)道霍山石斛、細(xì)莖石斛以及鐵皮石斛具有抗氧化活性。其后，黃石斛、矩唇石斛、疊鞘石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、曲軸石斛、玫瑰石斛、兜唇石斛、束花石斛、密花石斛、杯鞘石斛、晶帽石斛、報(bào)春石斛、翅梗石斛、長(zhǎng)矩石斛、球花石斛、黑毛石斛、流蘇石斛、華石斛、齒瓣石斛、大苞鞘石斛、馬鞭石斛、美花石斛、龍石斛、可愛(ài)石斛、紫瓣石斛、黃心石斛以及棒節(jié)石斛等的抗氧化活性功能也逐步被發(fā)現(xiàn)。

表1 已證實(shí)具抗氧化活性的石斛種Table 1 Dendrobium species with proven antioxidant activity

2 石斛抗氧化活性評(píng)價(jià)方法

石斛的抗氧化活性研究需要對(duì)其展開(kāi)準(zhǔn)確的抗氧化活性評(píng)價(jià)，因此，選擇適宜的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法顯得尤為重要。目前主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)石斛抗氧化活性，最常用的體外實(shí)驗(yàn)方法有自由基清除能力法、還原能力法、金屬離子螯合能力法與細(xì)胞模型法，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則以大、小鼠模型，人體模型以及其他模型(如果蠅模型與秀麗線蟲(chóng)模型)等活體生物模型為主。石斛抗氧化活性評(píng)價(jià)的方法較多，且各有優(yōu)缺點(diǎn)(見(jiàn)表2)，應(yīng)用時(shí)根據(jù)研究目的選擇恰當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

表2 石斛抗氧化活性常用評(píng)價(jià)方法匯總Table 2 Summary of current evaluation methods for the study of antioxidant activity of Dendrobium

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1 自由基清除能力法

抗氧化能力與自由基清除能力呈顯著正相關(guān)，因此體外自由基清除能力法常用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力，常用自由基有ABTS自由基、DPPH自由基、羥基自由基與超氧陰離子自由基等。研究發(fā)現(xiàn)自由基清除法具有便捷、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但受限于待測(cè)物質(zhì)成分組成、具體結(jié)構(gòu)以及抗氧化機(jī)制的差異，運(yùn)用此法應(yīng)同時(shí)測(cè)定物質(zhì)對(duì)多種自由基的清除能力，綜合比較，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性[18]。如Luo等[19]發(fā)現(xiàn)金釵石斛水提多糖對(duì)ABTS自由基的清除率顯著高于羥基自由基與DPPH自由基；而其關(guān)于疊鞘石斛多糖抗氧化活性的研究結(jié)果則顯示高濃度的疊鞘石斛多糖提取物能強(qiáng)力清除DPPH自由基，對(duì)ABTS自由基的清除效果則不明顯；Paudel等[20]則證實(shí)不同溶劑所提細(xì)莖石斛提取物對(duì)DPPH自由基清除能力不同。因此，在比較鐵皮與霍山兩種石斛多糖的抗氧化能力時(shí)，Zha等[21]綜合評(píng)價(jià)兩者對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基與烷基自由基的清除能力后，才得出霍山石斛多糖抗氧化能力更強(qiáng)的結(jié)論。

2.1.2 還原能力法

抗氧化劑都是還原劑，因而常用其還原能力來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化活性，常見(jiàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)有鐵離子還原能力(FRAP)與銅離子還原能力(CUPRAC)。Hao等[22]通過(guò)FRAP法探究霍山石斛多糖的還原能力時(shí)發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖還原能力一般，但能強(qiáng)力清除H2O2與羥基自由基。提示在物質(zhì)抗氧化活性的研究中，還原能力法需同自由基清除法聯(lián)合使用以增加結(jié)論的說(shuō)服力[23]。

2.1.3 金屬螯合能力評(píng)價(jià)法

石斛通過(guò)螯合金屬離子，抑制金屬離子的催化氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)起到抗氧化作用，因此其對(duì)金屬離子的螯合能力也可用于抗氧化活性的評(píng)價(jià)。疊鞘石斛多糖[24]與總黃酮提取液，以及鐵皮石斛提取物[25]均能較好的螯合Fe2+，且螯合率均同濃度呈正相關(guān)。

2.1.4 細(xì)胞模型

人體衰老或病變?cè)从诩?xì)胞長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，因此利用細(xì)胞模型評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性極為常見(jiàn)[26]。細(xì)胞模型評(píng)價(jià)法的關(guān)鍵在于細(xì)胞模型的構(gòu)建，如Zhao等[27]采用Jurkat細(xì)胞模型探究鼓槌石斛多糖對(duì)羥基自由基的清掃能力，Huang等[28]則通過(guò)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞模型證實(shí)鐵皮石斛有三種多糖具有氧化損傷的修復(fù)能力?？寡趸瘎┠鼙Ｗo(hù)衰老小鼠的心肌細(xì)胞，對(duì)抗氧化與自由基清除能力起到強(qiáng)化作用。有研究利用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型證實(shí)鐵皮石斛多糖能增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化性能，顯著改善心肌細(xì)胞凋亡[29]。Tang等[30]還利用60 mJ/cm2戶外紫外線(UVB)照射建立光老化成纖維細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖能清除UVB誘導(dǎo)的活性氧(ROS)，抑制光老化成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)的分泌，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β1)的表達(dá)，調(diào)節(jié)膠原蛋白生成降解平衡，對(duì)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞起到保護(hù)作用。

2.2 體內(nèi)試驗(yàn)

2.2.1 大、小鼠模型

生物體內(nèi)有內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，生物模型能更好模擬抗氧化物質(zhì)的作用環(huán)境，再通過(guò)體內(nèi)丙二醛(MDA)、各類抗氧化酶與非酶類抗氧化劑含量作指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化活性更具參考意義。體內(nèi)試驗(yàn)中，石斛抗氧化活性評(píng)價(jià)大多采用大、小鼠模型，大量實(shí)驗(yàn)表明石斛能提高血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)[32]、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)[2]水平，并降低MDA水平。應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)研究目的選擇具體機(jī)體氧化損傷小鼠模型：一是小鼠肝損傷模型，包括溴代苯致小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷[5]、酒精性肝損傷[33]、CCl4致肝損傷[34]以及糖尿病致肝損傷[35]等；二是腎損傷模型，其中，腎陰虛小鼠模型[2]較為常用，也有以順鉑治療引起的中毒性腎損害大鼠模型[36]探究金釵石斛對(duì)腎臟氧化應(yīng)激的改善作用的；三是葡聚糖硫酸鈉建立的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型[37]；四是D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型[38]等。

2.2.2 人體模型

人體模型只能用于臨床試驗(yàn)中，Yang等[39]便利用鐵皮石斛對(duì)慢性肝炎患者進(jìn)行治療的機(jī)會(huì)，觀察并研究鐵皮石斛對(duì)慢性肝炎患者免疫與抗氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果顯示，鐵皮石斛能很好改善慢性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群與抗氧化指標(biāo)(包括總抗氧化能力(T-AOC)、SOD、MDA及CAT)，促進(jìn)患者T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，提高患者的機(jī)體組織修復(fù)能力，證實(shí)鐵皮石斛在慢性肝炎患者治療中通過(guò)抗氧化功能起治療作用。但此模型只可用于藥物的臨床試驗(yàn)階段，且需通過(guò)倫理委員會(huì)同意。

2.2.3 其他模型

果蠅模型體積小，數(shù)目大，成本低，被用于石斛抗氧化活性的評(píng)價(jià)。Qiu[41]利用不同劑量鐵皮石斛多糖喂食果蠅，證明鐵皮石斛多糖通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因提高SOD、CAT等酶的活力，清除果蠅體內(nèi)的自由基進(jìn)而延長(zhǎng)壽命。此外，具有神經(jīng)細(xì)胞的多細(xì)胞生物秀麗線蟲(chóng)也被用于石斛抗氧化活性評(píng)價(jià)，Gao[42]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛復(fù)方制劑能降低秀麗線蟲(chóng)ROS水平，提高秀麗線蟲(chóng)SOD活力，起到延緩衰老的作用。

3 石斛發(fā)揮抗氧化活性的有效成分及其作用機(jī)制

石斛的抗氧化活性是體內(nèi)各種抗氧化活性成分綜合作用的結(jié)果，其所含的多糖、生物堿、黃酮、植物多酚以及聯(lián)芐類物質(zhì)等均具有抗氧化活性，并通過(guò)抑制氧化應(yīng)激與提高機(jī)體的抗氧化活性兩種機(jī)制發(fā)揮抗氧化作用。下文將對(duì)石斛中主要有效成分及其作用機(jī)制進(jìn)行綜述(見(jiàn)表3)。

表3 石斛活性成分的抗氧化作用機(jī)制Table 3 Antioxidant mechanism of active ingredients of Dendrobium

續(xù)表3(Continued Tab.3)

3.1 多糖

石斛多糖是石斛的重要功能活性物質(zhì)，以清除自由基的方式抑制氧化應(yīng)激，又可通過(guò)上調(diào)Nrf2(neclear factor erythroid 2-related factor 2)/HO-1(血紅素加氧酶1)信號(hào)通路的蛋白表達(dá)提高抗氧化活性[43]。目前，大量抗氧化活性研究圍繞石斛多糖展開(kāi)，其特性已基本明確：第一，石斛種不同,其多糖提取物抗氧化活性不同[10]，如霍山石斛、鐵皮石斛、金釵石斛以及鼓槌石斛多糖提取物的抗氧化活性存在顯著差異[44]；第二，同種石斛的莖、葉、花對(duì)應(yīng)多糖提取物所具抗氧化活性存在差異，如鐵皮石斛花在DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力與FRAP還原能力方面的抗氧化活性評(píng)價(jià)均顯著高于莖葉[45]；第三，同種石斛采用不同溶劑所得多糖提取物具不同抗氧化活性，如金釵石斛水溶性多糖的抗氧化活性高于堿溶性多糖[46]與聚二乙醇(PEG)提多糖[47]，鐵皮石斛的堿溶性多糖[48]與酶解多糖[49]抗氧化能力均高于水提多糖。因作為混合物的石斛多糖提取物抗氧化能力取決于多糖組分構(gòu)成情況，而石斛多糖單體組分的抗氧化活性又同其分子量[50]與分子構(gòu)型[51]相關(guān)，如分子量較大或較小的多糖抗氧化活性更強(qiáng)，疊鞘石斛、紫皮石斛、鐵皮石斛這類β構(gòu)型的酸性多糖清除自由基的活性比金釵、馬鞭等α構(gòu)型的酸性多糖更強(qiáng)[51]。

3.2 生物堿

生物堿是石斛類藥材中的一類活性成分，可清除氧化物質(zhì)以抑制氧化應(yīng)激，如霍山產(chǎn)鐵皮石斛[52]與霍山石斛中分離出生物堿均對(duì)羥基自由基有清除能力，但清除能力較低；石斛中的生物堿還可通過(guò)激活Nrf2(neclear factor erythroid 2-related factor 2)/ARE(antioxidant response element)信號(hào)通路，提高抗氧化活性，如金釵石斛生物堿上調(diào)此通路信號(hào)能降低CCl4肝損傷模型肝線粒體中MDA，H2O2和8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)的含量，使GSH含量及錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性增高[53]。

3.3 植物多酚

植物多酚是一種含有多元酚結(jié)構(gòu)的化合物，具有抗氧化活性的功能，石斛的抗氧化活性與石斛中多酚含量密切相關(guān)。石斛的植物多酚可通過(guò)清除自由基抑制氧化應(yīng)激，文獻(xiàn)顯示金釵石斛[54]、鐵皮石斛[55]、鼓槌石斛[56]以及霍山石斛[57]等多酚提取物均有不同程度的自由基清除能力，純化后的高濃度多酚提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力接近維生素C(Vc)。美花石斛中的部分石斛多酚具顯著的DPPH自由基清除能力，其中3，6，9-三羥基-3，4-二氫蒽-1(2H)-酮與2，4，7-三羥基-9，10-二氫菲等酚類化合物的抗氧化活性比Vc更高[58]，其能提高SOD、CAT、GSH[59]含量，增強(qiáng)GSH-Px[55]的活性，以保護(hù)機(jī)體不受氧化損傷。

3.4 黃酮

黃酮苷類化合物不僅可以清除活性自由基，終止自由基鏈反應(yīng)，螯合起催化作用的金屬離子[60]，還能抑制產(chǎn)生自由基的部分酶活性，從而起到抗氧化作用。石斛體外抗氧化性能同其黃酮含量有較強(qiáng)相關(guān)性，含黃酮最多的提取物對(duì)ABTS與DPPH自由基的清掃能力最強(qiáng)[61]。金釵石斛與鐵皮石斛的黃酮均具有抗氧化活性，其中，金釵石斛黃酮苷中芹菜素-6-C-α-鼠李糖-8-C-β-葡萄糖苷具抗氧化性能，且與給藥濃度存在顯著正相關(guān)[62]；鐵皮石斛莖、葉、花中的黃酮均具有一定抗氧化活性，花中所含黃酮對(duì)自由基的清除效果最好[63]。

3.5 聯(lián)芐類

聯(lián)芐類化合物為石斛的生物活性成分之一，抗氧化性是聯(lián)芐類物質(zhì)的基本性質(zhì)，且其體外抗氧化活性隨純度增大而增強(qiáng)。Li等[64]先后從鐵皮石斛中分離出8種具一定抗氧化活性的聯(lián)芐類化合物，其中7種單體能通過(guò)清除自由基(DPPH自由基)的方式抑制氧化應(yīng)激；石斛酚是石斛聯(lián)芐類物質(zhì)中的單體成分，能提高細(xì)胞中SOD活力與總抗氧化能力(T-AOC)，減少M(fèi)DA，使細(xì)胞具更強(qiáng)抗氧化活性[65]。聯(lián)芐類物質(zhì)還能通過(guò)抑制NO自由基的生成發(fā)揮抗氧化作用[66]，但尚未找到具體遺傳機(jī)制相關(guān)研究。

3.6 其它

石斛還含有其它活性物質(zhì)，如菲類[67]、芴酮等，且均具有強(qiáng)大的自由基清除能力[68]。如鐵皮石斛中花色苷對(duì)自由基的清除能力強(qiáng)于Vc[69]，兜唇石斛中一種抗氧化活性多肽能直接參與抗氧化物酶的代謝活動(dòng)，因其肽序列尾端的絡(luò)氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)提高對(duì)過(guò)氧自由基(ROO)的清除能力，增強(qiáng)紅細(xì)胞的抗氧化活性[70]。

4 結(jié)語(yǔ)

石斛所含生物活性成分極為豐富，是潛力巨大的天然抗氧化劑，大量抗氧化活性研究圍繞其展開(kāi)，但還需深入研究。首先在石斛種上的研究集中于鐵皮、霍山、金釵、鼓槌等少數(shù)分布較廣的石斛，其余石斛種缺少研究；其次在石斛抗氧化活性評(píng)價(jià)方法上集中于自由基清除法、還原能力法與金屬螯合能力法的應(yīng)用，細(xì)胞模型與體內(nèi)試驗(yàn)應(yīng)用較少，且由于石斛抗氧化活性缺乏權(quán)威的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致不同種石斛以及不同有效成分的抗氧化活性大小難以比較；最后對(duì)石斛抗氧化活性成分研究主要以多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)鑒定及功能活性研究為主，圍繞黃酮、酚類、聯(lián)芐類等抗氧化活性更高的活性物質(zhì)展開(kāi)研究較少，尤其缺乏作用機(jī)制的研究，對(duì)石斛抗氧化活性成分的高級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定也不深入，且結(jié)構(gòu)鑒定與功能活性研究相對(duì)獨(dú)立，很少有研究將二者聯(lián)系起來(lái)，從其結(jié)構(gòu)上探究其抗氧化活性機(jī)制。