劉文杰，李隴強，唐佳慧，姜淑玲，楊 平，陳春晨，郭文強

井岡山大學醫(yī)學部，吉安 343009

深色有隔內生真菌(dark septate endophytes，DSE)作為一群定殖于植物根內且具有深色菌絲和明顯橫隔的特殊真菌，其生活史中的某段時期存在于植物根的表皮、皮層甚至維管束組織的細胞內或細胞間隙中，并能夠形成獨特的微菌核，但不會在根組織內轉化成病原菌而引起植物病理學特征[1]。大部分植物體內的內生真菌都屬于DSE范疇，隨著自然界長期的進化選擇，該類真菌與宿主之間形成了動態(tài)平衡關系。在植物的生長周期中，內生真菌在一定程度上具有促進植物生長、提高宿主植物的抗病蟲害以及抵御環(huán)境壓力的作用。同時，內生真菌與宿主植物次生代謝產物的積累也有密不可分的關系[2]。DSE廣泛分布于地球的所有生境中，越來越多的研究表明，DSE可能具有與根際土壤真菌類似的生態(tài)學功能，在不同生境下的微生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要共生作用，由此也可能具有異于普通生境下真菌的代謝途徑，能夠產生結構新型、活性獨特的天然產物[3,4]。

甘草屬于豆科甘草屬多年生草本植物，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳的功效，主要道地產區(qū)分布在寧夏、甘肅、內蒙古和新疆等地，因特殊的藥效而被廣泛使用[5]。而不同產地甘草藥材在品質上存在差異，其主要原因可能為外部環(huán)境因子如產地氣候、土壤等造成產地差異性[6]。近年來，關于甘草中的DSE功能研究逐漸引起了人們的重視，相關研究表明，從甘草內生真菌發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了與宿主相同的有效成分，如甘草酸、甘草苷、異甘草苷、甘草次酸、甘草素等[7-9]。此外，從甘草中分離的內生真菌中篩選具有生物活性的菌株，聚焦其活性化合物也已成為天然產物研究的新方向[10,11]。鑒于此，本研究將展開對不同產地甘草來源內生真菌種群多樣性和抗菌活性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品

新鮮健康的烏拉爾甘草樣品分別于2018年9月、10月采集于內蒙古赤峰市、甘肅張掖市、寧夏吳忠市。甘草樣品采集后置于4 °C冰箱中保藏，并且由北京中醫(yī)藥大學孫志蓉教授鑒定為烏拉爾甘草。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(真菌2號)：葡萄糖(10 g/L)，麥芽糖(20 g/L)，谷氨酸鈉(10 g/L)，甘露糖醇(20 g/L)，KH2PO4(0.5 g/L)，玉米漿(1 g/L)，酵母浸粉(3 g/L)，MgSO4·7H2O(0.3 g/L)和蒸餾水1L，調節(jié)pH為6.5。

1.1.3 實驗儀器

超凈工作臺SW-CJ-2D(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；高壓滅菌器KXQ-LS(上海博訊有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082P03Ⅳ(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；旋轉蒸發(fā)器RE-2000A(鄭州科泰實驗設備有限公司)；低溫冷卻液循環(huán)泵DLSK-5/20(鄭州科泰實驗設備有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHK-Ⅲ(鄭州科泰實驗設備有限公司)；超聲波清洗器KQ-300E；電子天平BSA-124SNMR。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌分離純化

甘草樣品經過75%酒精浸泡處理1 min后無菌水沖洗干凈，加水充分研碎并吸取上清液，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于28 °C孵育3～5天。從中分離出具有不同形態(tài)的真菌菌落，將其重新接種到新的PDA培養(yǎng)基，并在28 °C下再孵育培養(yǎng)36 h。根據在PDA平板上的菌落形態(tài)(顏色、質地、邊界類型和徑向生長速率等)，將其分為不同的形態(tài)類型，最終得到內生真菌純菌株。

1.2.2 內生真菌種屬鑒定

將數(shù)據由Gardner模型擬合得到如圖2所示的曲線，圖中各點表示實測數(shù)據，曲線為擬合結果，各點與曲線基本重合。

從該來源的內生真菌中提取DNA并進行PCR反應，實驗采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增內部轉錄的間隔區(qū)(ITS)[12-14]。PCR產物由睿博生物科技有限公司(中國，北京)純化和測序。通過BLAST分析將鑒定出的序列與GenBank數(shù)據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的其他序列進行比較分析，并在ClustalW中進行比對[15]。利用Godinho提出的標準來分析驗證GenBank數(shù)據庫的BLAST結果：對于查詢覆蓋率和序列同一性≥98%，該物種種屬可以被確定；對于覆蓋率和序列同一性在95%～97%之間的可以確定到種，而對于覆蓋率和序列同一性≤95%，則可以認為是新菌[16]。系統(tǒng)進化分析則是采用MEGA X進行的，N-J法被用來估計種屬進化距離，其自舉值是根據1 000次重復計算而得出的結果[17]。

1.2.3 內生真菌發(fā)酵培養(yǎng)與處理

將各菌株接種到含有100 mL真菌2號液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 °C靜置發(fā)酵培養(yǎng)30天。發(fā)酵完成后將發(fā)酵混合物用等體積的乙酸乙酯超聲萃取2次，經減壓蒸餾獲得粗提物后，甲醇溶解，并用微孔濾膜過濾除去不溶固體雜質。揮干溶劑后稱重，用甲醇重新溶解，配成濃度為5 mg/mL的溶液，低溫冷藏備用。

1.2.4 指紋圖譜分析

真菌粗提物在HPLC系統(tǒng)(Waters Co.)中分析，該系統(tǒng)包含996型二極管陣列紫外檢測器和ODS-C18色譜柱(YMC，4.6 mm×250 mm，5 μm)。40 min內從5%～100%甲醇梯度洗脫，并在100%甲醇條件下繼續(xù)洗脫10 min。

1.2.5 抗菌活性測試

以草分支桿菌、枯草芽孢桿菌、恥垢分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌作為抗菌活性指示菌，利用紙片擴散法進行粗提物抗菌活性篩選與評價。氯霉素(0.1 μg/μL)被用作抗菌活性測定的陽性對照。將紙片(直徑10 mm)吸取菌株甲醇粗提液后揮干，并放置在鑒定菌瓊脂表面上。37 ℃下培養(yǎng)24 h后，測量五種鑒定菌下紙片的生長抑制區(qū)直徑。

2 結果與討論

2.1 甘草來源內生真菌種屬分析與鑒定

對該來源的134株內生真菌進行序列分析發(fā)現(xiàn)其包含子囊菌類和接合菌類兩大真菌類群。依據Godinho的分類標準，對提交到GenBank數(shù)據庫的序列與相似菌株進行覆蓋率和相似度的比對。結果可知大部分菌株與其最接近的種屬展示了較高的相似度，可以確定到種屬，由此發(fā)現(xiàn)不同產地甘草內生真菌群落組成也各不相同。內蒙產地的55株甘草內生真菌歸屬于11個種屬(Penicillium、Aspergillus、Byssochlamys、Talaromyces、Cladosporium、Fusarium、Clonostachys、Arthopyrenia、Alternaria、Sarocladium、Parastagonospora)，其中以青霉屬和鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌屬，分別占分離菌株總數(shù)的41.81%和16.36%。甘肅產地的41株內生真菌隸屬于6個種屬(Cladosporium、Penicillium、Aspergillus、Fusarium、Ascomycota、Mucor)，其中以曲霉屬為優(yōu)勢類群,占分離菌株總數(shù)的39.02%。寧夏產地的38株內生真菌隸屬于9個種屬(Penicillium、Aspergillus、Ascomycota、Cladosporium、Nigrospora、Hannaella、Alternaria、Didymella、Phoma)，以曲霉屬為優(yōu)勢菌，占分離菌株總數(shù)的23.68%。綜上，青霉和曲霉屬為各地甘草內生真菌的優(yōu)勢菌屬，但各產地之間真菌種屬間差異性較大，初步發(fā)現(xiàn)甘肅產地甘草的內生真菌種群多樣性較其他兩地低(見表1)。

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

將所有甘草內生菌株的ITS序列輸入MEGA X進行進化分析，并通過構建系統(tǒng)發(fā)生樹來對甘肅、內蒙和寧夏的甘草內生真菌的親緣性進行種系發(fā)育研究(見圖1～3)。

圖1 內蒙甘草來源內生真菌的系統(tǒng)發(fā)生關系Fig.1 Phylogenetic relationship of endophytic fungi from G.uralensis in Inner Mongolia

圖2 甘肅甘草來源內生真菌的系統(tǒng)發(fā)生關系Fig.2 Phylogenetic relationship of endophytic fungi from G.uralensis in Gansu

2.2 甘草來源內生真菌抗菌活性

將所有菌株采用真菌2號培養(yǎng)基靜置發(fā)酵30天后，獲得134個代謝粗提物。在對其進行五種鑒定菌的抗菌活性篩選后，發(fā)現(xiàn)35株內生真菌的次級代謝產物表現(xiàn)出較好的抗菌活性，綜合活性率為26.1%。其中菌株AspergilluswesterdijkiaeCFGC-5-04、Fusariumsp.CFGC-5-14、Parastagonosporasp.CF

GC-5-27、FusariumoxysporumJWGG-5-50、DidymellamacrostomaJWNG-2-37、AlternariaangustiovoideaJWNG-2-39表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，同時的Cladosporiumsp.JWNG-2-15和Fusariumsp.CFGC-5-14的代謝產物對金黃色葡萄球菌顯示出較好的抑制活性(見表2)，顯示出潛在的代謝產物研究價值。

表2 甘草來源內生真菌次級代謝產物抗菌活性Table 2 Antibacterial activity of secondary metabolites of endophytic fungi from G.uralensis

圖3 寧夏甘草來源內生真菌的系統(tǒng)發(fā)生關系Fig.3 Phylogenetic relationship of endophytic fungi from G.uralensis in Ningxia

2.3 內生真菌次級代謝產物分析

通過對所有甘草來源內生真菌的次級代謝產物的HPLC-UV圖譜進行分析后，發(fā)現(xiàn)其有多個菌株的代謝產物具有特征的指紋圖譜(見圖4)。

圖4 部分內生真菌次級代謝產物HPLC-UV指紋圖譜Fig.4 Comparison of metabolite fingerprints using HPLC-UV in representative endophytic fungi

其中活性菌株PenicilliumoxalicumCFGC-5-34、PenicilliumhalotoleransJWGG-5-46、Cladosporiumsp.JWNG-2-15的指紋圖譜中分別表現(xiàn)出λmax320 nm、λmax270 nm、λmax285 nm的系列的紫外吸收，預示著活性內生真菌次級代謝產物中具有系列的天然產物。

3 討論

已有研究表明，DSE的分布范圍包含了不同的生境：從沿海灘涂到內陸高原山地；從熱帶、溫帶到凍原地區(qū)及南北極地區(qū)均有DSE的分布。越來越多的研究結果支持DSE與宿主植物之間能形成互惠共生的內在關系[1]。并且，DSE能夠促進植物對土壤營養(yǎng)物質的吸收利用、增強植物的抗逆性(包括抗旱、抗寒、耐重金屬等)、增強植物的抗病能力、影響植物群落、對不良環(huán)境植被的恢復和重建都有促進作用[18]。近年來，傳統(tǒng)中藥中DSE越來越受到重視，其不僅在植物生理學、代謝組學等方面表現(xiàn)出巨大的研究價值，還被發(fā)現(xiàn)是良好生物活性天然產物的重要資源庫。

本研究以不同產地的甘草樣品為研究對象，研究其可培養(yǎng)內生真菌的物種多樣性和生物活性。與以往的研究相似，我們發(fā)現(xiàn)該來源DSE群落中既有優(yōu)勢種，也有稀有真菌種，屬于地方性、冷適應型和世界性類群，表現(xiàn)出有趣而獨特的生態(tài)學特征。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一些具有高度生物活性的菌株，有待進一步研究其次級代謝產物的結構和活性的多樣性，這些未開發(fā)的DSE菌株可能是獨特的微生物資源。

通過對不同產地甘草內生真菌進行分離純化來考察其生物多樣性，在參考已有報道研究中對甘草內生真菌分離方法的基礎上[5]，對甘肅、內蒙和寧夏甘草主產地的DSE進行分析研究發(fā)現(xiàn)3個產區(qū)分離率、真菌種屬多樣性等方面都具有較大的差異性，其顯示出可能的甘草地域性與內生真菌種屬之間的潛在關系。對于中藥的道地性等問題上，傳統(tǒng)觀點認為道地藥材是植物基因和環(huán)境相互作用的產物，多集中于特定的地理因素或氣候因素等植物外環(huán)境的作用，很少從植物內環(huán)境方面進行考慮，而內生菌又是植物內環(huán)境的重要組成部分[19]。研究也推測DSE是道地藥材在特定區(qū)域分布的重要原因之一，也是道地藥材與非道地藥材品質差異的一個潛在原因。同時還發(fā)現(xiàn)植物DSE能夠影響中藥材的道地性，能夠提高藥用植物對某些次級代謝產物的累積[20,21]。

對不同產地甘草內生真菌的次級代謝產物的抗菌活性篩選與評價，發(fā)現(xiàn)各個產地甘草的內生真菌對多種病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，同時HPLC-UV分析也發(fā)現(xiàn)多個系列類型的天然產物存在，這在挖掘其次級代謝產物的結構多樣性和生物活性方面具有潛在的研究價值。因此，分析甘草DSE的種屬多樣性，對相關菌株代謝產物的深入研究仍有必要，其對于甘草的道地性意義闡明和活性天然產物挖掘研究都具有重要的意義。