秦天麗，陳彥伍，吳石麗，張 凡，李明明，何紅平,

1云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院；2云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明 650500

山楝Aphanamixispolystachya是楝科(Meliaceae)山楝屬(Aphanamixis)植物，在我國(guó)主要分布于廣東、廣西、云南等地區(qū)[1,2]。山楝屬植物始載于《新華本草綱要》，其味辛，性溫。歸肝、腎經(jīng)，主治風(fēng)寒痹癥、屈伸不利、拘攣、四肢麻木等癥狀[3]。山楝之所以備受關(guān)注，是源于其種子、樹(shù)皮、葉子、果實(shí)等作為植物藥在民間的廣泛使用[4]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道山楝中化學(xué)成分主要包括檸檬苦素類衍生物、三萜、二萜、倍半萜和甾體等化合物[5-9]?；钚匝芯勘砻鳎摲N分離得到的化合物具有殺蟲(chóng)、抗腫瘤、抗炎等生物活性[9-12]。前期我們課題組對(duì)楝科山楝屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行了系列研究和報(bào)道[13-16]，近期本課題組對(duì)山楝枝葉展開(kāi)了化學(xué)成分研究工作，從其95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分離得到了9個(gè)化學(xué)成分。本文詳細(xì)介紹了9個(gè)化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance NEO 400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；Agilent 1260 infinity 液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；半制備柱Zorbax SB-C18柱(5 μm，9.6 mm×250 mm)；美國(guó)Agilent UPLC/Q-Tof液質(zhì)聯(lián)用儀；JASCO P-1020旋光儀；Bio-Rad FTS-135紅外光譜儀；島津紫外-2401PC分光光度計(jì)(日本東京島津)；Sephadex LH-20(40～70 μm，Amersham Pharmacia Biotech AB)；硅膠(80-100目和100～200目)；試驗(yàn)中所用試劑均為分析純或色譜純。

山楝枝葉于2017年11月采自云南省西雙版納，由昆明植物所陳瑜老師鑒定為山楝屬植物山楝Aphanamixispolystachya的干燥枝葉。標(biāo)本現(xiàn)存于云南中醫(yī)藥大學(xué)民族中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保存編號(hào)為H20171105。

1.2 提取與分離

將21 kg干燥的山楝枝葉粉碎，用5倍體積的95%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，所得提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，得總浸膏2.6 kg。浸膏用蒸餾水溶解后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，分別得到石油醚部分0.7 kg和乙酸乙酯部分1.3 kg。

乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮(50∶1→6∶4)及氯仿-甲醇(10∶1→0∶1)體系進(jìn)行梯度洗脫，TLC檢測(cè)合并后得到8個(gè)組分Fr.1～8。其中Fr.1經(jīng)MCI柱色譜，甲醇/水(9∶1)脫除色素，再經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-丙酮梯度(梯度情況)洗脫，得到四個(gè)組分Fr.1-1～Fr.1-4。 Fr.2經(jīng)RP-18色譜柱分段(甲醇-水，20%→100%)，以及Sephadex LH-20柱(甲醇)和HPLC半制備分離，以乙腈/水(48∶52)為流動(dòng)相(tR= 34 min)，得到化合物3(12 mg)，以乙腈/水(69∶31)為流動(dòng)相(tR= 32 min)，得到化合物4(27 mg)。Fr.3經(jīng)RP-18色譜柱分段(甲醇-水，20%→100%)，得四個(gè)組分(Fr.3-1～Fr.3-4)，F(xiàn)r.3-2經(jīng)RP-18色譜柱和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)柱分離得到化合物5(236 mg)。Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)柱純化得到化合物9(135 mg)。Fr.4 經(jīng)硅膠柱層析和重結(jié)晶純化，得到化合物6(136 mg)，剩余部分再經(jīng)Sephadex LH-20柱(甲醇)和HPLC半制備得到2(10 mg，乙腈/水，58∶42，tR= 34 min)、1(8 mg，乙腈-水，58∶42，tR= 36 min)。 Fr.5經(jīng)MCI柱色譜，甲醇/水(9∶1)脫除色素，再經(jīng)RP-18色譜柱分段(甲醇-水，10%→100%)，得到得5個(gè)組分(Fr.5-1～Fr.5-5)。Fr.5-2經(jīng)硅膠，Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)柱色譜后得到化合物7(150 mg)和化合物8(86 mg)。

1.3 活性測(cè)試

采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7模型評(píng)價(jià)化合物抑制NO產(chǎn)生的活性[17,18]。實(shí)驗(yàn)以NG-單甲基-L-精氨酸乙酸鹽(L-NMMA)作陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)置空白組、模型組(LPS組)、溶劑組(DMSO組)、溶劑模型(DMSO+LPS)、陽(yáng)性藥物組(LPS+L-NMMA)和化合物實(shí)驗(yàn)組。RAW264.7細(xì)胞在37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)條件下接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1.5×105細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h。在實(shí)驗(yàn)組化合物以梯度變化，分別加入100、50、25、12.5和6.25 μg/mL的待測(cè)樣品，孵育1 h后加入20 μL LPS作用18 h。收集上清，用Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO水平。同時(shí)用MTS法評(píng)價(jià)RAW264.7細(xì)胞的存活率，以消除受試化合物細(xì)胞毒性的干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～9的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-9

表1 化合物1和2的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)Table 1 NMR spectral data of compounds 1 and 2 in CDCl3

圖2 化合物1和2的主要1H-1H COSY和 HMBC相關(guān)Fig.2 1H-1H COSY and HMBC correlations of 1 and 2

化合物7白色粉末；C7H6O4，ESI-MS：m/z155 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.34(1H，br s，H-2)，6.69(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，7.32(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：123.4(C-1)，115.9(C-2)，145.2(C-3)，151.7(C-4)，124.0(C-5)，117.9(C-6)，170.4(COOH)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，故鑒定其為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物8白色粉末；C9H8O5，ESI-MS：m/z181 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.24(1H，d，J= 16.0 Hz，H-2)，7.55(1H，d，J= 16.0 Hz，H-3)，7.06(1H，d，J= 2.0 Hz，H-5)，6.94(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J= 8.0 Hz H-7)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：170.0(C-1)，116.4(C-2)，146.9(C-3)，127.7(C-4)，115.0(C-5)，146.6(C-6)，149.3(C-7)115.4(C-8)，122.7(C-9)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，故鑒定其為反式咖啡酸。

2.2 活性測(cè)試結(jié)果

對(duì)新化合物活性測(cè)定結(jié)果顯示，化合物1和2抑制NO生成的IC50值分別為1 162.0和259.3 μg/mL(陽(yáng)性對(duì)照L-NMMA的IC50為14.7 μg/mL)，對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO生成沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)山楝枝葉的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到了9個(gè)化合物，包含倍半萜、二萜和酚酸類成分。化合物1和2為兩個(gè)新的含有十元環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜，其生源上可能是由愈創(chuàng)木型倍半萜1,5-開(kāi)環(huán)得來(lái)。化合物4、7、8和9為從該植物中首次分離。迄今為止，從山楝中分離的化學(xué)成分主要為檸檬苦素類化合物和一些鏈狀二萜類成分[5-8,14,15]，倍半萜、半日花烷型二萜類和酚酸成分報(bào)道較少，本研究豐富了山楝中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)類型，為山楝的資源化利用提供理論基礎(chǔ)。