徐鑫梅，易 歡，賴先榮，馮 圖，李 琪，蔣桂華?，范 剛?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川成都 611137；3.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700）

小檗皮為小檗科植物甘肅小檗Berberis kansuensisSchneid.及其同屬多種植物的干燥內(nèi)皮［1］，能清熱、解毒、燥濕，常用于治療痢疾、尿路感染、腎炎、結(jié)膜炎等疾病［2-3］。《晶珠本草》 中記載有“小檗皮性涼、糙，能斂諸毒，干黃水”［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小檗皮可有效降低四氧嘧啶所致糖尿病模型小鼠血糖水平，能防治糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變，并能改善受損的視網(wǎng)膜微血管形態(tài)［5-8］。小檗皮為典型的多基原藏藥材，同屬多種植物均能入藥。課題組前期對小檗皮進(jìn)行了詳細(xì)的資源調(diào)查及文獻(xiàn)考證［9］，發(fā)現(xiàn)目前各藏醫(yī)院、藏藥廠及藥材市場上使用的主流品種包括甘肅小檗Berberis kansuensisSchneid.、鮮黃小檗Berberis diaphanaMaxim.和匙葉小檗Berberis vernaeSchneid.等。小檗皮藥材的基原多樣性和混淆使用不利于市場監(jiān)管，也影響其質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床使用。因此，建立簡便、可行的品種鑒別方法對于小檗皮藥材的質(zhì)量控制具有重要的意義。

現(xiàn)代研究表明，小檗皮藥材主要含有小檗堿、木蘭花堿、巴馬汀等生物堿類成分［10-12］。張琦等［13］采用HPLC 法測定了小檗皮中小檗堿的含量；莫家祺等［14］采用紫外分光光度法測定了總生物堿含量；李琪等［15］采用HPLC 法對小檗皮藥材中6 種成分進(jìn)行含量測定。然而，單一成分或多成分的含量測定仍不夠全面，不能完全反映小檗皮藥材的內(nèi)在質(zhì)量。指紋圖譜具有信息量大、特征性強、整體性和模糊性等特點，可充分反映各成分分布的整體情況［16-18］。因此，本研究首次建立了小檗皮藥材的HPLC 指紋圖譜，運用相似度評價、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）對不同品種的小檗皮藥材進(jìn)行綜合評價，以期為其基原鑒定及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Sartorius BP121s 電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；ULUP-I-10T 優(yōu)普超純水機（成都超純科技有限公司）；CQ-250 超聲波清洗器（上海必能信有限公司）。

蟾毒色胺內(nèi)鹽、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品均由本課題組自制，經(jīng)HPLC 檢測純度均＞99%；木蘭花堿（批號MUST-18071701，純度＞99%）對照品購于成都曼思特生物科技有限公司；藥根堿（批號Y-023-141201）、巴馬?。ㄅ朒-015-150808）、小檗堿（批號Y-035-150818）對照品均購于四川賽因斯特生物科技有限公司，純度均＞98%。磷酸、乙腈為色譜純；甲醇、鹽酸為分析純；水為超純水。本研究共收集15 批小檗皮，采用植物分類學(xué)及課題組前期建立的DNA 條形碼方法［9］鑒定分別為鮮黃小檗Berberis diaphana、匙葉小檗Berberis vernae和甘肅小檗Berberis kansuensis，具體信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WondaSil? C18-WR 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～12%A；10～15 min，12%～15%A；15～20 min，15%～18% A；20～30 min，18%A；30～40 min，18%～30%A）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 樣品信息

2.2 對照品溶液制備 精密稱取小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿、蟾毒色胺內(nèi)鹽、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷適量，置于5 mL 量瓶中，甲醇制成1.500、1.725、1.950、1.925、2.950、2.590 mg／mL 貯備液。分別精密量取2 mL 置于同一25 mL 量瓶中，甲醇制成每1 mL 含小檗堿0.120 mg、巴馬汀0.138 mg、藥根堿0.156 mg、木蘭花堿0.154 mg、蟾毒色胺內(nèi)鹽0.236 mg、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷0.207 mg 的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末（過3 號篩）約0.2 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-70%甲醇（1∶100）溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，鹽酸-70%甲醇（1∶100）溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 空白試驗 取鹽酸-70% 甲醇（1∶100）溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)溶劑對小檗皮指紋圖譜測定沒有干擾。

2.4.2 完整試驗 取樣品（S15）約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，記錄120 min 的色譜圖。結(jié)果，60 min 后未出現(xiàn)色譜峰，可完整記錄小檗皮樣品各化學(xué)成分信息。

2.4.3 精密度試驗 取樣品（S15）約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果，以木蘭花堿為參照峰時，各共有峰相對保留時間RSD＜0.6%，相對峰面積RSD＜2.9%。將其色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004 年A 版）進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)其相似度均大于0.999，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取樣品（S15）約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下于0、1、2、3、4、6、12、24 h 進(jìn)樣。結(jié)果，以木蘭花堿為參照峰時，各共有峰相對保留時間RSD＜0.6%，相對峰面積RSD＜3.0%。將其色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004 年A 版）進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)其相似度均大于0.999，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取樣品（S15）6 份各0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣。結(jié)果，以木蘭花堿為參照峰時，各共有峰相對保留時間RSD＜2.9%，相對峰面積RSD＜3.0%。將其色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004年A 版）進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)其相似度均大于0.975，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 樣品含量測定 參照課題組前期建立的HPLC 含量測定方法［15］，對15 批樣品6 種成分含量進(jìn)行測定，并將結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）。PCA 模型自動擬合選擇了4 個主成分，其累計貢獻(xiàn)率為94.6%，PCA 得分圖見圖3A，可知鮮黃小檗和匙葉小檗不能得到有效的區(qū)分。此外，PLS-DA 分析參數(shù)分別為R2X ＝84.6%、R2Y ＝81.3%、Q2＝43.0%，表明模型良好；PLS-DA 得分圖見圖3B，與PCA 結(jié)果相似，兩者仍然不能得到明顯的分類。

2.6 HPLC 指紋圖譜建立及相似度評價

2.6.1 參照峰選擇 木蘭花堿為小檗皮質(zhì)量評價的重要指標(biāo)之一，每批樣品中均含有這種成分，其色譜峰在色譜圖中分離度良好，峰面積最大，保留時間和峰面積較為穩(wěn)定，故選擇其作為參照峰。

2.6.2 指紋圖譜建立 15 批藥材按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，其色譜圖以AIA 格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004 年A 版）。將S1 號樣品的圖譜設(shè)為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)為0.5 min，進(jìn)行多點校正和色譜峰匹配，最終確定了13 個共有峰，得到指紋圖譜疊加圖，并生成對照指紋圖譜，見圖1。

圖1 15 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.6.3 共有峰確認(rèn) 將小檗皮對照指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比對，指認(rèn)了其中6 個共有峰，分別為蟾毒色胺內(nèi)鹽（2號峰）、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（4 號峰）、木蘭花堿（6 號峰）、藥根堿（11 號峰）、巴馬?。?2 號峰）、小檗堿（13 號峰），見圖2。以木蘭花堿（6 號峰）作為參照物峰（S），指定其相對峰面積值為1.000，計算指紋圖譜中其他共有特征峰的相對峰面積比值，見表2。

圖2 小檗皮中各成分色譜圖

表2 15 批樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積

2.6.4 相似度評價 將15 批藥材的HPLC 指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004 年A版）進(jìn)行相似度評價。結(jié)果，除S5 相似度為0.779 外，其余樣品均大于0.85，其中鮮黃小檗0.895～0.956，匙葉小檗0.779～0.962，甘肅小檗0.955～0.964，大多數(shù)樣品相似度較高，表明不同品種之間成分組成相似，見表3。

表3 15 批樣品相似度

2.7 模式識別 將15 批樣品的13 個共有色譜峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行模式識別分析，包括PCA 和PLS-DA，數(shù)據(jù)采用自動規(guī)格化處理后，首先用無監(jiān)督模式識別方法觀察樣品的自然聚集。模型自動擬合選擇了4 個主成分，其累計貢獻(xiàn)率為81.4%，表明前4 個成分能反映原始數(shù)據(jù)81.4%的信息。所有樣品的PCA 得分圖見圖3C，可知3 個基原的小檗皮樣品被明顯分為3 類。

為進(jìn)一步驗證小檗皮不同品種之間的差異，采用有監(jiān)督的模式識別方法（PLS-DA）對所有樣品進(jìn)行模式識別分析。結(jié)果，PLS-DA 模型參數(shù)為R2X ＝76.0%，R2Y ＝97.2%，Q2＝86.6%，表明建立的模型較穩(wěn)定且預(yù)測性良好。PLS-DA 得分圖見圖3D，可知分類結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，3 個品種被明顯聚集在不同區(qū)域。由此表明，各品種之間成分組成存在一定的差異。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明以乙腈-0.2%磷酸洗脫時主要色譜峰的分離度明顯提高，且峰形較好，保留時間適中?？疾炝?10、230、256、270、300 nm等不同波長下的吸收圖譜，發(fā)現(xiàn)在210 nm 波長下色譜峰信息多，峰型良好，吸收較強。此外，還考察了色譜柱、柱溫等條件，最終確定為“2.1”項下條件。

圖3 15 批小檗皮樣品PCA、PLS-DA 分析得分圖

3.2 提取條件優(yōu)化 考察了冷浸、回流、超聲3 種不同提取方法，結(jié)果表明超聲提取效率高。考察了30% 甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇及鹽酸-70%甲醇（1∶100），發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取效果較好，加入1% 鹽酸后部分色譜峰峰型改善，提取效率提高?？疾炝?5、30、60 min 提取時間，發(fā)現(xiàn)60 min 提取率接近30 min，高于15 min，最終選擇超聲30 min 提取。考察了20、50、100 mL 提取溶劑用量，發(fā)現(xiàn)50 mL 溶劑可充分提取藥材中的化學(xué)成分，并且各成分在色譜圖上具有適合的響應(yīng)值。

3.3 模式識別分析 本研究采用HPLC 法建立了小檗皮化學(xué)指紋圖譜，并以6 號峰木蘭花堿為參照峰，確定了13 個特征峰，鑒定了其中6 種成分，能全面反映藥材內(nèi)在質(zhì)量。大部分藥材樣品的相似度均大于0.85，表明所建立的HPLC 指紋圖譜可用于小檗皮質(zhì)量控制。

15 批樣品HPLC 圖譜輪廓基本一致，但共有峰峰面積相差較大。因此，在HPLC 指紋圖譜的基礎(chǔ)上本研究對其進(jìn)行PCA 和PLS-DA 分析，發(fā)現(xiàn)2 種模式識別方法均能很好地區(qū)分3 個品種，而以6 種成分含量為指標(biāo)時不能得到明顯的分類。綜上所述，HPLC 指紋圖譜結(jié)合模式識別方法可有效區(qū)分小檗皮不同基原品種，表明體現(xiàn)整體性的HPLC 指紋圖譜能更好地檢測各成分的種間變化，可為該藥材基原鑒定和質(zhì)量控制提供參考。