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        竹節(jié)參水提物對宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡的影響

        2021-03-07 07:05:02瀅,黃
        中成藥 2021年1期
        關(guān)鍵詞:竹節(jié)參水提物提取物

        劉 瀅,黃 宙

        (1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南湘潭 411102;2.湘潭市中心醫(yī)院,湖南湘潭 411100)

        竹節(jié)參為五加科植物,性溫、味甘、味苦,具有滋補強壯、散瘀止痛及止血祛痰功效[1-4],廣泛用于產(chǎn)后虛弱、咳嗽痰多及跌打損傷患者中[5]?,F(xiàn)代藥理結(jié)果表明[6],竹節(jié)參具有抗炎、延緩衰老、降血糖及抗腫瘤作用。皂苷是竹節(jié)參的主要活性成分(約占23.6%),且三萜類皂苷具有較高含量,具有解熱、抗菌、抗癌等生物作用。國內(nèi)學(xué)者研究表明[7],天然藥物具有較低的毒副作用,臨床使用時不宜產(chǎn)生耐藥性,且對實體瘤具有良好的療效,但是在宮頸癌中的作用機制研究相對較少。因此,本研究以宮頸癌Hela 細(xì)胞作為對象,探討竹節(jié)參水提物在宮頸癌Hela細(xì)胞中的作用機制及對細(xì)胞凋亡的影響,以期為宮頸癌治療提供新思路。

        1 材料

        1.1 細(xì)胞 宮頸癌Hela 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫,將其接種在含10% 胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基中,在含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng),取第3 代對數(shù)生長者,備用。

        1.2 藥材 竹節(jié)參產(chǎn)地湖北恩施,購于恩施竹節(jié)參種植基地,經(jīng)專家鑒定為正品。將藥材根莖干燥粉碎后純凈水回流提取3 次,濾液濃縮,即得提取物,提取率為25.8%,加入 DMEM 培養(yǎng)基依次制成 0(陰性對照)、50、100、150 μg/mL。

        1.3 儀器 見表1。

        表1 儀器信息

        2 方法

        2.1 細(xì)胞處理 取第3 代培養(yǎng)的宮頸癌Hela 細(xì)胞,0.25%EDTA 進(jìn)行消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中至單層細(xì)胞。將0(陰性對照)、50、100、150 μg/mL 竹節(jié)參提取物分別加入宮頸癌Hela 細(xì)胞中(100 μL/孔),每種質(zhì)量濃度設(shè)置5 個復(fù)孔,將培養(yǎng)板放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,連續(xù)進(jìn)行48 h 培養(yǎng)[8]。

        2.2 細(xì)胞凋亡測定 采用一步法TUNEL 染色測定。取各組處理后的細(xì)胞,加入0.25% EDTA-胰蛋白酶完成細(xì)胞消化,調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL,接種在96 孔板中,每孔200 μL,放入培養(yǎng)箱中48 h。在12、24、36、48 h 后向細(xì)胞中滴加TUNEL 檢測液(含TdT 酶2 μL、熒光標(biāo)記液48 μL),避光孵育,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞情況,并且在波長480 nm、發(fā)射光540 nm 處測定OD值,每張圖片取5 個視野,在400 倍下完成凋亡細(xì)胞核計數(shù),獲得凋亡率[9]。

        2.3 細(xì)胞周期測定 采用流式細(xì)胞計數(shù)儀測定。取生長良好的宮頸癌Hela 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種在6 孔培養(yǎng)板中,連續(xù)培養(yǎng)24 h 后換入新鮮培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)48 h 后加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化懸浮,4 ℃下收集細(xì)胞。采用預(yù)冷的PBS 緩沖液(pH 值為7.4)對細(xì)胞沖洗2 次,加入-20 ℃預(yù)冷的乙醇3 mL,吹打均勻后放置在-20 ℃冰箱中固定24 h。測定前對各組細(xì)胞離心10 min(1 424×g),PBS 緩沖液沖洗2次,去除上層清液后重懸于200 μL 0.1 mmol/L EDTA 溶液中,30 min 避光孵育后加入35 μL 2% Tritonx-100、114 μL 150 μg/mL PI 溶液,充分混合后避光反應(yīng)10 min,將最終獲得的混合液于EPICS XL 型流式細(xì)胞儀中完成細(xì)胞周期測定[10]。

        2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 采用Hoechst 33342 熒光染色觀察。取不同質(zhì)量濃度竹節(jié)參水提物處理后的細(xì)胞,離心10 min后去除上層清液,加入10 g/L Hoechst 33342 熒光染色液,避光染色10 min 后去除染液,PBS 洗滌2 次后涂片,晾干后在熒光顯微鏡下觀察,波長為340 nm,保存結(jié)果[11]。

        2.5 凋亡相關(guān)基因測定

        2.5.1 RNA 提取 向各組處理后的細(xì)胞中加入500 μL trizol,混合、均勻后加入氯仿0.2 mL,劇烈振蕩15 s,常溫下靜置2~3 min 后離心15 min(12 000 r/min),獲得3層液體(上層為水相,中間層與下層為有機相)。取RNA沉淀,轉(zhuǎn)移到新的EP 管中,加入0.5 mL 異丙醇,混合后放在-20 ℃冰箱中,10 min 離心(1 194×g),獲得凝膠狀沉淀(即為RNA)。充分洗滌RNA,加入250 μL DEPC、750 μL 乙醇,乙醇沖洗沉淀,離心5 min(2 315×g),取沉淀放入工作臺上干燥20 min。利用紫外分光度儀檢測RNA 濃度,并完成RNA 提純(以核糖核酸酶作為空白對照),在260 nm 波長處測定吸光度。采用脫氧核糖核酸酶處理RNA 后,放入冰箱中[12]。

        2.5.2 PCR 檢測 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)法測定P53、Bax、Casepase-3 mRNA 表達(dá)水平,引物序列見表2。設(shè)定PCR 反應(yīng)條件為30 ℃,10 min;42 ℃,30 min;99 ℃,5 min;5 ℃,5 min,連續(xù)進(jìn)行35個循環(huán),最后在72 ℃下完成10 min 延長。擴增產(chǎn)物放入1.5%瓊脂凝膠中電泳,完畢后采用UVP 凝膠圖像完成灰度值的測定,以β-actin為內(nèi)參[13]。

        表2 引物序列

        2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS18.0 軟件進(jìn)行處理,計數(shù)資料以百分率表示,組間比較采用卡方檢驗;計量資料以()表示,組間比較采用t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,并呈濃度、時間依賴性,36 h 后可達(dá)50.0%以上,見表3。

        3.2 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌HeLa 細(xì)胞周期的影響 竹節(jié)參水提取物主要作用于宮頸癌Hela 細(xì)胞G0/G1期與S期,隨著其劑量升高逐漸集中于G0/G1期,見表4。

        3.3 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌HeLa 細(xì)胞形態(tài)的影響 Hoechst 33342 熒光染色顯示,0 μg/mL 竹節(jié)參水提物下Hela細(xì)胞形態(tài)均一,結(jié)構(gòu)相對完整;在50、100、150 μg/mL下,Hela 細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡,細(xì)胞形態(tài)固縮,可見凋亡小體,并且劑量越高,細(xì)胞凋亡越明顯,見圖1。

        表3 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用(%,, n=4)

        表3 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用(%,, n=4)

        注:與0 μg/mL 比較,?P<0. 05;與12 h 比較,#P<0.05。

        表4 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞周期的影響(%,, n=4)

        表4 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞周期的影響(%,, n=4)

        注:與0 μg/mL 比較,?P<0.05。

        圖1 不同劑量竹節(jié)參水提取物下宮頸癌Hela 細(xì)胞形態(tài)

        3.4 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響 竹節(jié)參水提取物可增加宮頸癌Hela 細(xì)胞中P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá),并呈濃度依賴性,見表5、圖2。

        表5 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響(, n=4)

        表5 竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響(, n=4)

        注:與0 μg/mL 比較,?P<0.05。

        4 討論

        圖2 不同劑量竹節(jié)參水提取物下宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡基因表達(dá)

        宮頸癌是女性發(fā)生率較高的惡性腫瘤,具有發(fā)病率高、治愈率低、致死率高等特點[14]。目前,化療、手術(shù)與放療占據(jù)宮頸癌治療的主要地位,但是無論何種方法均存在明顯的局限性,且治療均無法做到徹底、副作用較大,患者治療后復(fù)發(fā)率較高,導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期生存率較低[15]。竹節(jié)參是臨床上常用的中藥,具有滋補強壯、散瘀止痛、止血祛痰等作用[16]。體外及動物實驗結(jié)果表明[17],竹節(jié)參水提物對于肝癌、鼻咽癌、肺癌及胃癌等實體瘤具有良好的抗腫瘤作用,能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時,竹節(jié)參水提物能抑制血管的形成,有助于增強機體免疫功能。有研究表明[18]:竹節(jié)參具有抗炎及潛在的抗腫瘤作用,其水提物能顯著增強機體免疫水平,能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。因此,本研究基于當(dāng)前研究,分析了竹節(jié)參水提物對于宮頸癌HeLa 細(xì)胞的作用機制,結(jié)果表明:竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,且呈濃度依賴性,能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞的凋亡率隨著竹節(jié)參水提取物濃度、作用時間的延長增加,36 h時竹節(jié)參水提取物對宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖抑制基本達(dá)到50.0%以上;竹節(jié)參水提取物作用于宮頸癌Hela 細(xì)胞G0/G1期與S 期;隨著竹節(jié)參水提取物濃度升高,竹節(jié)參水提取物對于宮頸癌Hela 細(xì)胞作用集中于G0/G1期,說明竹節(jié)參水提物能抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞的增殖、生長,能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,藥物多作用于細(xì)胞生長初期,且藥物濃度越高,作用效果越明顯。

        細(xì)胞凋亡指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死,其過程不是被動的過程,而是主動的過程,多涉及基因的激活、表達(dá)與調(diào)控作用,是為了更好的適應(yīng)生存而主動爭取的一種死亡過程[19]。但是,對于腫瘤細(xì)胞而言其生長無限增殖,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡紊亂,會對宿主產(chǎn)生明顯的不適,嚴(yán)重者可危及生命。P53 基因?qū)儆谌梭w抑癌基因,含有大量的脯氨酸,其失活對腫瘤的形成具有重要的意義。臨床研究表明[20],P53 基因是相對重要的抗癌基因,其野生型能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,防止癌變的發(fā)生,亦可輔助細(xì)胞基因修復(fù)。但是,P53基因發(fā)生突變后,則會增加癌變發(fā)生率。Bax 基因?qū)儆谕每谷藛慰寺】贵w,屬于Bcl-2 基因家族中細(xì)胞凋亡的促進(jìn)基因,其過度表達(dá)能拮抗Bcl-2 的保護(hù)效應(yīng),能使得細(xì)胞趨于死亡。研究表明:Bax 基因是人體主要凋亡基因,可與Bcl-2 形成異二聚體,能抑制Bcl-2 的產(chǎn)生,是人體相對重要的促細(xì)胞凋亡基因之一。Caspase-3 在細(xì)胞凋亡中具有不可替代的作用,可以被多種因素活化,在CTL 細(xì)胞殺死中發(fā)揮重要作用。臨床研究表明:Caspase-3 與DNA 修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)等有關(guān)。本研究中,Hoechst 33342 熒光染色結(jié)果表明:竹節(jié)參水提物0 μg/mL 時HeLa 細(xì)胞形態(tài)均一且結(jié)構(gòu)相對完整;而竹節(jié)參水提取物 50、100、150 μg/mL下HeLa 細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡,細(xì)胞形態(tài)固縮,可見凋亡小體;竹節(jié)參水提取物能增加宮頸癌HeLa 細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá),且竹節(jié)參水提取物濃度越高,凋亡相關(guān)基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)越高,說明竹節(jié)參水提物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,能增加凋亡基因表達(dá)水平,進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,竹節(jié)參水提物體外能抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖,能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自噬與凋亡,可能與調(diào)控凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)有關(guān),具有潛在的抗癌作用。

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