黃 鶯，徐 芳

（武漢市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢 430022）

肺間質(zhì)纖維化是由多種原因引起的肺間質(zhì)炎癥性疾病，病變主要累及肺間質(zhì)［1］，也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管，是許多間質(zhì)性肺疾病的最終病理表現(xiàn)，也是目前肺纖維化的一個(gè)主要發(fā)病特點(diǎn)及病變部位。其發(fā)病機(jī)制尚未確定，研究表明，可能與環(huán)境、粉塵接觸、吸煙、年齡及服用某些藥物等有關(guān)［2-3］。近年來(lái)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）已被眾多研究者認(rèn)為是成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源［4］，而與EMT 的發(fā)生密切相關(guān)的TGF-β1-Samd 信號(hào)通路已成為目前研究的重要聚點(diǎn)。研究證實(shí)Samd3 的缺失或減少可使TGF-β1 出現(xiàn)功能性減弱，對(duì)纖維化的發(fā)生有很好的拮抗作用［5］。有研究者發(fā)現(xiàn)虎杖流浸膏可有效抑制肺纖維大鼠肺組織中TGF-β1的表達(dá)強(qiáng)度，但具體作用蛋白尚未定論，本研究前期發(fā)現(xiàn)虎杖水提物對(duì)A549 細(xì)胞TGF-β1-Samd 信號(hào)通路下游部分因子有很好的調(diào)控作用，此次研究選取虎杖中活性成分總蒽醌為研究對(duì)象，利用中醫(yī)藥靶點(diǎn)豐富、副作用少、適用于臨床的優(yōu)勢(shì)分析探討對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠模型中TGFβ1-Samd 信號(hào)的干預(yù)作用［6-7］，并用Smad3 siRNA 阻斷TGFβ1-Smad 信號(hào)通路及Smad3 蛋白抑制劑進(jìn)行干預(yù)，探索Taopc 治療肺纖維化的作用機(jī)制，為肺纖維化的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)大鼠繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）20140007。博來(lái)霉素（哈爾濱博萊制藥有限公司，批號(hào)20170411）；Smad3 抑制劑（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)20170516）；虎杖總蒽醌（寶雞市辰光生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)47.82%）；TGF-β、Smad3、a-SMA、CTGF、E-CAD 基因引物、Smad3 siRNA 質(zhì)粒構(gòu)建均由上海生工生物工程有限公司合成；CDNA 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；HYP、TNF-α、VEGF、MMP-2、間質(zhì)膠原蛋白Ⅰ、間質(zhì)膠原蛋白Ⅲ試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號(hào)E20170721A、E20170727A、E20170618A、E20170604A、E201700803A、E20170620A）；CS-6400 全自動(dòng)生化分析儀（迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司）。

1.2 分組與給藥 參考文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道的方法。取大鼠50 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為空白組、博來(lái)霉素組、虎杖總蒽醌組、Smad3 siRNA 基因沉默大鼠+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部切開(kāi)皮膚脫毛并剝離出氣管，注射BLM 10 mg／kg，空白組給予同等劑量生理鹽水。造模后次日，虎杖總蒽醌組給予虎杖總蒽醌（400 mg／kg）灌胃，Smad3 siRNA+虎杖總蒽醌組給予虎杖總蒽醌灌胃并尾靜脈注射Smad3 siRNA 質(zhì)粒（3 mL／kg），Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組給予Taopc 灌胃于腹腔注射SIS3（2 mg／kg），空白組灌胃給予同等劑量生理鹽水，連續(xù)4 周。取右肺，RT-PCR 檢測(cè)肺組織勻漿中上皮細(xì)胞標(biāo)志物（E-cad）、間皮細(xì)胞標(biāo)志物（α-SMA）及信號(hào)通路相關(guān)分子Smad3、TGFβ1、CTGF的mRNA 的蛋白表達(dá)變化。取左肺組織勻漿后離心，堿裂解法檢測(cè)肺組織HYP 水平，摘眼球取血后離心，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清TNF-α、VEGF、MMP-2、間質(zhì)膠原蛋白Ⅰ、間質(zhì)膠原蛋白Ⅲ的水平。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 血清指標(biāo) 于96 孔板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔，加入標(biāo)準(zhǔn)液，除標(biāo)準(zhǔn)孔外依次加入待檢標(biāo)本、稀釋液封板，室溫或37 ℃下孵育1 h，棄去液體，于洗板機(jī)上清洗3 次，加入封閉緩沖液室溫或孵育30 min 避光，隨后加入底物顯色孵育30 min后加入終止液，450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。

1.3.2 RT-PCR Real-time PCR 法檢測(cè)TGF-β1、Smad3、α-SMA、CTGF、E-cadmRNA 表達(dá)。取肺組織適量，研磨并加入1 mL Trizol 混合均勻，提取上層RNA 溶解物后測(cè)濃度。取總RNA 2μg 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃，5 s，合成cDNA，PCR 引物序列見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃，15 s，60 ℃退火延伸45 s 采集信號(hào)，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)組別做3 次定量檢測(cè)，采用公式Q＝2-ΔΔCt，GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，組間比較根據(jù)方差是否齊性，采用LSD法或Games-Howell 法；等級(jí)資料組間比較采用Ridit 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織E-cad、TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGFmRNA 水平 與空白組比較，博來(lái)霉素組大鼠肺組織E-cad水平降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平升高（P＜0.05）；與博來(lái)霉素組比較，虎杖總蒽醌組大鼠肺組織E-cad 水平升高（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平降低（P＜0.05）；與虎杖總蒽醌組比較，SiRNA+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織E-cad 水平降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad3、a-SMA、CTGF 水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織E-cad、 TGF-β1、 Smad3、 a-SMA、 CTGF mRNA 水平比較（， n＝10）

表2 各組大鼠肺組織E-cad、 TGF-β1、 Smad3、 a-SMA、 CTGF mRNA 水平比較（， n＝10）

注：與博來(lái)霉素組比較，?P＜0. 05；與空白組比較，△P＜0. 05；與虎杖總蒽醌組比較，#P＜0.05。

2.2 大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平 博來(lái)霉素組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平高于空白組（P＜0.05）；與博來(lái)霉素組比較，虎杖總蒽醌組大鼠血清TNFα、VEGF、MMP-2 水平降低（P＜0.05）；與虎杖總蒽醌組比較，SiRNA+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 各組大鼠肺組織HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平 博來(lái)霉素組大鼠肺組織HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平高于空白組（P＜0.05）；與博來(lái)霉素組比較，虎杖總蒽醌組大鼠肺組織HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平降低（P＜0.05）；與虎杖總蒽醌組比較，SiRNA+虎杖總蒽醌組、Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織HYP 水平及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表3 各組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平比較（， n＝10）

表3 各組大鼠血清TNF-α、VEGF、MMP-2 水平比較（， n＝10）

注：與博來(lái)霉素組比較，?P＜0. 05；與空白組比較，△P＜0. 05；與虎杖總蒽醌組比較，#P＜0.05。

表4 各組大鼠肺組織HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平比較（， n＝10）

表4 各組大鼠肺組織HYP 及血清CollagenⅠ、CollagenⅢ水平比較（， n＝10）

注：與博來(lái)霉素組比較，?P＜0. 05；與空白組比較，△P＜0. 05；與虎杖總蒽醌組比較，#P＜0.05。

3 討論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有運(yùn)動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞過(guò)程，在肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中占據(jù)重要地位，也是肺纖維化疾病發(fā)展的最終方向［10］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外信號(hào)可通過(guò)作用多條信號(hào)通路途徑導(dǎo)致肺纖維化的產(chǎn)生，進(jìn)而產(chǎn)生肺間質(zhì)纖維化，而與EMT 發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路主要包括TGF-β 信號(hào)通路、PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路及NF-κB 信號(hào)通路等，以上通路中TGF-β 信號(hào)通路與EMT 的發(fā)生關(guān)系最為密切，可誘導(dǎo)多種上皮細(xì)胞EMT，被認(rèn)為是各器官纖維化發(fā)生的總開(kāi)關(guān)（包括肺纖維化）［11］。近年來(lái)，關(guān)于TGF-β信號(hào)通路在肺纖維化疾病中的研究多集中于TGFβ1-smad信號(hào)通路的研究，目前眾多被研究藥物多通過(guò)調(diào)控TGFβ1／Smad 直接或間接抑制成纖維細(xì)胞的增殖，減輕肺組織ECM 的生成和沉積，達(dá)到治療肺纖維化疾病的目的［12］。TGFβ1 是TGF-β 家族中水平最豐富的一種調(diào)控因子，生物作用廣泛，具有促進(jìn)膠原分泌，促進(jìn)纖維化細(xì)胞增殖，增加蛋白酶抑制物水平，增加ECM 沉積等作用，在肺纖維化過(guò)程中具有重要作用［5］。TGF-β 通過(guò)與受體結(jié)合將信號(hào)傳導(dǎo)至下游Smads 家族，具體傳遞過(guò)程為TGF-β1 首先與TGF-βRⅡ二聚體結(jié)合，形成復(fù)合物，再結(jié)合TGF-βRⅠ二聚體形成異四倍體，使TGF-βRⅠ的GS 區(qū)被磷酸化激活，而TGF-βRⅠ磷酸化激活Smad2 和Smad3，磷酸化的Smad2或Smad3 結(jié)合Smad4 形成低聚體復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外纖維發(fā)生蛋白的表達(dá)增加，加速纖維化的進(jìn)展。因此，對(duì)TGF-β1／Smads 信號(hào)通路的研究，對(duì)于預(yù)防及治療肺纖維化性疾病具有重要意義。

肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中，在各種各種損傷因素的作用下，肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT 并使標(biāo)志性蛋白ɑ-SMA 表達(dá)上調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad 逐漸丟失，細(xì)胞外基質(zhì)大量生成和沉積，導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化發(fā)生［13］。此外，TGF-β1／Smad 信號(hào)通路被激活，TGF-β1 信號(hào)下傳首先接觸Smad 蛋白，建立起細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核間的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而使TGF-β 下游效應(yīng)因子CTGF、MMP-2、VEGF 表達(dá)上調(diào)加重纖維化程度［14］。CollagenⅠ、CollagenⅢ作為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）主要成分，是由Fb 及其轉(zhuǎn)型后的MFb 合成和分泌，ɑ-SMA 是Fb 轉(zhuǎn)型為MFb 的標(biāo)志，肺纖維化疾病產(chǎn)生時(shí)，TGF-β1／Smads 信號(hào)通路被激活，ɑ-SMA 表達(dá)上調(diào)，間接使CollagenⅠ、CollagenⅢ合成增多，增加ECM，加重纖維化程度［15］。HYP 主要存在于膠原蛋白內(nèi)，隨著膠原蛋白生成的增多而增高，故可作為反映膠原水平的間接指標(biāo)，常被用于評(píng)價(jià)肺纖維化［16］。TNF-α 可促進(jìn)肺膠原纖維的過(guò)度增生，并增加細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，造成肺纖維化的病理改變［17］。

本研究采用氣管注入博來(lái)霉素（BLM，10 mg／kg）建立肺纖維化大鼠模型，通過(guò)Smad3 基因沉默及運(yùn)用Smad蛋白抑制劑進(jìn)行干預(yù)，觀察虎杖總蒽醌對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中TGFβ1-smad 信號(hào)通路的影響［18］。研究發(fā)現(xiàn)，虎杖總蒽醌可升高大鼠肺組織中E-cad 水平，降低TGF-β、Smad3、ɑ-SMA、CTGF 水平，而SiRNA+虎杖總蒽醌組及Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織中Ecad 水平降低，TGF-β、Smad3、ɑ-SMA、CTGF 水平升高，與虎杖總蒽醌組形成相反趨勢(shì)；肺組織及血清指標(biāo)檢測(cè)可知，虎杖總蒽醌組肺組織HYP、血清CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNF-ɑ、VEGF、MMP-2 水平均有所降低，SiRNA+虎杖總蒽醌組與Smad3 抑制劑+虎杖總蒽醌組大鼠肺組織HYP、血清CollagenⅠ、CollagenⅢ、血清TNF-ɑ、VEGF、MMP-2水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，與虎杖總蒽醌組形成相反趨勢(shì)。

此次研究可知，虎杖總蒽醌可能通過(guò)阻斷Smad3-TGFβ1 信號(hào)傳導(dǎo)通路，減少TGF-β 的表達(dá)，阻斷該信號(hào)通路減少TGF-β 下游效應(yīng)因子表達(dá)，并降低肺組織HYP 及血清TNF-ɑ 炎癥因子作用，進(jìn)一步抑制上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而延緩肺纖維化的進(jìn)展。此外，本研究選取中藥虎杖為研究對(duì)象，利用中醫(yī)藥靶點(diǎn)豐富、副作用少、適用于臨床的顯著優(yōu)勢(shì)，為臨床攻克肺間質(zhì)纖維化疾病提供了一定的實(shí)驗(yàn)支撐及用藥指導(dǎo)。但本研究?jī)H選取TGFβ1-smad信號(hào)通路進(jìn)行研究，與肺間質(zhì)纖維化相關(guān)的其他通路如PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路及NF-κB 信號(hào)通路等方面并未進(jìn)行相關(guān)研究，此外，本次研究數(shù)據(jù)方面稍顯不足，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，對(duì)中藥虎杖在肺間質(zhì)纖維化方面進(jìn)行更加深入研究，為臨床攻克肺間質(zhì)纖維化疾病提供一定實(shí)驗(yàn)支撐及用藥指導(dǎo)。