張毅靖 甘劍峰 王永福何國棟吳映秀唐洪梅

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

嶺南地區(qū)春夏季氣溫高，且多雨多濕；夏季廣東地區(qū)居民有飲涼茶的習(xí)慣，更易傷及脾氣，因此嶺南地區(qū)脾虛證多發(fā)［1］。脾虛臨床表現(xiàn)為蜷縮倦怠、便溏腹瀉、消瘦乏力等。研究表明，脾虛患者的胃腸動(dòng)力和吸收能力較弱，胃腸激素也存在異常［2］。

健脾祛濕膏為廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，臨床上廣泛用于脾虛證，效果顯著，但具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用苦寒瀉下法結(jié)合勞倦過度法復(fù)制脾虛腹瀉大鼠模型，以血中胃動(dòng)素（motilin，MTL）、血管活性腸肽（vasocative intestinal peptide，VIP）和生長抑制素（somatostain，SS）、結(jié)腸及腎臟水通道蛋白（aquaporin，AQP）、結(jié)腸閉鎖蛋白o(hù)ccludin 和連接蛋白Claudin-1 的水平為研究指標(biāo)，探究健脾祛濕膏對(duì)大鼠胃腸功能的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 4 周齡健康雄性SD 大鼠40 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量約90 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)TCMF1-2019045。全部大鼠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2018-0092，晝夜節(jié)律為12 h／12 h，環(huán)境溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度55%～68%，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 試劑與藥物 健脾祛濕膏（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院膏方室提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥檢室檢測為合格制劑，批號(hào)20190808）；參苓白術(shù)散顆粒（山西華康藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z14020399，批號(hào)20190103）。番瀉葉（廣州至信藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)190501）由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥檢室何嘉侖中藥師鑒定為正品。大鼠胃動(dòng)素（MTL）ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)M06014790）；大鼠血管活性肽（VIP）ELISA 試劑盒［伊艾博（武漢）科技股份有限公司，批號(hào)9J126M］；大鼠生長抑制素（SS）ELISA 試劑盒 ［伊艾博（武漢）科技股份有限公司，批號(hào)9J126M］；D-木糖水平測試試劑盒（北極索萊寶科技有限公司，批號(hào)BC4395）；活性炭（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)R019802）；BCA 蛋白濃度測試試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號(hào)080919190917）；蘇木素伊紅染色劑（北京雷根生物科技有限公司，批號(hào)1009A19）；D-（+）-木糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)D19N9S75493）。ECL 化學(xué)發(fā)光底物（美國Millipore 公司，批號(hào)WBKLS0500）；RIPA 裂解液（批號(hào)P0013B）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（批號(hào)ST506）、一抗稀釋液，批號(hào)（P0256）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（H+L）（批號(hào)A0280）均購自碧云天生物科技有限公司；Occludin 抗體（美國Abcam 公司，批號(hào)RA20770）；Claudin-1 抗體（美國CST 公司，批號(hào)#4933）。

1.3 儀器 AL1240 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；BGE-140 電熱鼓風(fēng)干燥箱（博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MagNa Lyser 勻漿儀［羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司］；ZD-85 型氣浴恒溫振蕩器（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）；5810R 臺(tái)式高速大容量離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；1510 型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；H-7500 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）。ChemiDoc MP 型全能型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；165-8001 型垂直板電泳槽（美國Bio-Rad 公司）；TS-2 型水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 藥液制備

2.1.1 番瀉葉水液 稱取番瀉葉適量，加純化水室溫下浸泡30 min，加熱至沸騰后繼續(xù)加熱10 min。過濾后濃縮，使藥物質(zhì)量濃度為1.2 g／mL，于4 ℃冰箱中保存［3］。

2.1.2 健脾祛濕膏藥液 稱取健脾祛濕膏42 g，加入200 mL純化水，攪拌至溶解，使藥液質(zhì)量濃度為0.21 g／mL，于4 ℃冰箱中保存，每次灌胃前用溫水隔水加熱至室溫，用畢放回冰箱。

2.1.3 參苓白術(shù)散藥液 稱取參苓白術(shù)散100 g，加入200 mL純化水，攪拌至溶解，使藥液質(zhì)量濃度為0.5 g／mL，于4 ℃冰箱中保存，每次灌胃前用溫水隔水加熱至室溫，用畢放回冰箱。

2.2 模型建立 40 只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、健脾祛濕膏組（簡稱“膏方組”）和陽性藥參苓白術(shù)散組（簡稱“陽性藥組”），每組10 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，第4天記錄各組大鼠體質(zhì)量，為正式實(shí)驗(yàn)第1 天。自正式實(shí)驗(yàn)第1 天起，除空白組外其余大鼠每日上午給予冰番瀉葉水煎液灌胃1 次，給藥劑量為10 mL／kg。除空白組外，各組大鼠晚上置于水桶中游泳1 次至力竭，標(biāo)志為大鼠入水后不再掙扎游動(dòng)，鼻尖沉入水中5 s，無法浮出水面。造模持續(xù)14 d，實(shí)驗(yàn)第15 天進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，挑選造模成功的大鼠給藥［3］。

2.3 給藥 實(shí)驗(yàn)第15 天起，膏方組按照2.1 g／kg 的臨床等效劑量給藥，陽性組按5 g／kg 的臨床等效劑量給藥，空白組給予一定劑量的純化水灌胃，持續(xù)給藥14 d。

高中有一次和同學(xué)結(jié)伴出去玩，行李丟同學(xué)那里之后我去買飲料。眾所周知的嘛，火車上飲料不僅貴而且有各種不安全隱患。結(jié)果回來的路上，一個(gè)小孩扯住了我褲子。年紀(jì)大概十歲不到，臉上兩條淚痕沒干，明顯是哭過。

2.4 取材 分別于造模結(jié)束后和給藥結(jié)束后1 d，各組大鼠禁食不禁水12 h，手指輕按大鼠腹部刺激排便，收集糞便。禁食結(jié)束后給予大鼠一定量D-木糖溶液，代謝籠收集5 h 尿液。實(shí)驗(yàn)第30 天取材，配制新鮮的碳末混懸液，每只大鼠定量給予2 mL 碳末混懸液，記錄碳末混懸液和注射器的總質(zhì)量，計(jì)算每只大鼠實(shí)際灌服的碳末質(zhì)量，并根據(jù)公式胃內(nèi)殘留率＝ ［（含碳末的胃全重-洗凈后的胃凈重）／（2 mL 碳末與注射器總質(zhì)量-空白注射器質(zhì)量）］×100%進(jìn)行計(jì)算。15 min后，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛，麻醉，解剖取腹主動(dòng)脈血，分別用抗凝管和非抗凝管收集；取胃、由幽門到盲部的消化管和腎臟，測量碳末推進(jìn)長度和小腸總長度，測量完畢后剪取結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剪開，生理鹽水洗凈內(nèi)容物，一部分保存于4%多聚甲醛中，另一部分保存于1.5 mL 離心管，先于冰中保存；稱量胃全重，剪開胃后用生理鹽水洗凈內(nèi)容物，再次稱得胃凈重，分別置于冰中凍存。腹主動(dòng)脈血靜置30 min 后離心15 min（3 500 r／min），取血清和血漿，大鼠尿液離心15 min（3 500 r／min）后取上清液。所有樣品后期均轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。

2.5 指標(biāo)檢測 取大鼠血清和血漿，ELISA 法檢測血清SS及血漿MTL、VIP 水平。腎臟和結(jié)腸分別加適量PBS 緩沖液后在冰上勻漿，BCA 蛋白試劑盒定量檢測總蛋白濃度，ELISA 法檢測腎臟勻漿液中AQP2 和結(jié)腸勻漿液AQP3 水平。取各組大鼠尿液上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作，計(jì)算D-木糖排泄率。參照HE 染色法制備結(jié)腸石蠟切片，包括梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、染色等步驟，切片后光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)腸形態(tài)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，數(shù)據(jù)若服從正態(tài)分布且方差齊性，則采用單因素方差分析，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài) 冰番瀉葉水煎液結(jié)合過度游泳14 d 后，模型組、膏方組、陽性藥組大鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢、皮毛光澤黯淡且凌亂、喜好扎堆、大便稀溏等情形，提示脾虛腹瀉模型復(fù)制成功。

3.2 糞便含水量 采用烘干法測定。如表1 所示，模型組、膏方組和陽性藥組大鼠糞便含水量較空白組升高（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，膏方組、陽性藥組大鼠糞便含水量較模型組降低（P＜0.05）。

表1 健脾祛濕方對(duì)大鼠糞便含水率的影響（， n＝10）

表1 健脾祛濕方對(duì)大鼠糞便含水率的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0. 01；與模型組比較，#P＜0.05。

3.3D-木糖排泄率 如表2 所示，模型組、膏方組、陽性藥組大鼠D-木糖排泄率均低于空白組（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，給藥組大鼠D-木糖排泄率較模型組升高（P＜0.05）。

表2 健脾祛濕方對(duì)大鼠D-木糖排泄率的影響（，n＝10）

表2 健脾祛濕方對(duì)大鼠D-木糖排泄率的影響（，n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0. 01；與模型組比較，#P＜0.05。

3.4 結(jié)腸狀態(tài) 如圖1 所示，HE 染色后可見杯狀細(xì)胞、腺體和黏膜層表層；各組大鼠結(jié)腸黏膜層細(xì)胞排列整齊，表層均無明顯水腫；空白組大鼠腺體無明顯萎縮；模型組大鼠固有層腺體出現(xiàn)較明顯的萎縮；藥物干預(yù)后，給藥組大鼠結(jié)腸固有層腺體萎縮有所改善。

圖1 各組大鼠結(jié)腸形態(tài)（×100）

表3 健脾祛濕方對(duì)大鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進(jìn)率的影響（， n＝10）

表3 健脾祛濕方對(duì)大鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進(jìn)率的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，??P ＜0. 01；與模型組比較，# P ＜0.05，##P＜0.01。

3.6 胃腸激素水平 如表4 所示，與空白組比較，模型組大鼠血漿VIP、血清SS 水平升高（P＜0.01），血漿MTL 水平降低（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，與模型組比較，給藥組大鼠血漿MTL 水平升高（P＜0.05），血清SS、血漿VIP 水平降低（P＜0.05）。

表4 健脾祛濕方對(duì)大鼠胃腸激素水平的影響（， n＝10）

表4 健脾祛濕方對(duì)大鼠胃腸激素水平的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0. 01；與模型組比較，#P＜0.05。

3.7 結(jié)腸AQP3、腎臟AQP2 水平 如表5 所示，與空白組比較，模型組大鼠腎臟AQP2 水平升高（P＜0.01），結(jié)腸AQP3 水平降低（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，與模型組比較，給藥組大鼠結(jié)腸AQP3 水平升高（P＜0.05），腎臟AQP2 水平降低（P＜0.05）。

表5 健脾祛濕方對(duì)大鼠結(jié)腸AQP3、腎臟AQP2 水平的影響（， n＝10）

表5 健脾祛濕方對(duì)大鼠結(jié)腸AQP3、腎臟AQP2 水平的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0. 01；與模型組比較，#P＜0.05。

3.8 結(jié)腸Occludin、Claudin-1 蛋白表達(dá) 如表6、圖2 所示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸Occludin、Claudin-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；藥物干預(yù)后，與模型組比較，給藥組大鼠結(jié)腸Occludin、Claudin-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

表6 健脾祛濕方對(duì)大鼠結(jié)腸Occludin、Claudin-1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝10）

表6 健脾祛濕方對(duì)大鼠結(jié)腸Occludin、Claudin-1 蛋白表達(dá)的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

圖2 各組大鼠結(jié)腸Occludin、Claudin-1 蛋白表達(dá)

4 討論

健脾祛濕膏為廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由白術(shù)、黃連、五指毛桃、何首烏、白芍、柴胡、黑棗等多味藥材組成。制備工藝遵照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)嶺南膏方的制備與合理使用專家共識(shí)》，首先將各飲片置于煎藥機(jī)中，加入8 倍量的水浸泡過夜，煎煮提取兩次后濃縮而成。參苓白術(shù)散方為臨床上常用于治療脾虛濕盛泄瀉，關(guān)于參苓白術(shù)散的相關(guān)研究也較為深入［4-5］。因此本實(shí)驗(yàn)選參苓白術(shù)散作為陽性對(duì)照藥。

MTL 是一種多肽類胃腸激素，能促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)和刺激胃蛋白酶分泌，加速胃對(duì)內(nèi)容物的排出，可促進(jìn)胃容積的恢復(fù)［6］。SS 為生長抑制素，可減弱胃腸運(yùn)動(dòng)，減緩胃排空［7］。VIP 為抑制性腦腸肽，可直接作用于胃平滑肌上的受體，使平滑肌和括約肌舒張，抑制小腸的運(yùn)動(dòng)，使胃腸運(yùn)動(dòng)減弱［8］。與空白組對(duì)比，模型組MTL 水平顯著降低而VIP 和SS 水平顯著升高，提示模型大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，導(dǎo)致胃內(nèi)殘留率升高而小腸推進(jìn)率降低。此外，VIP 顯著升高，導(dǎo)致模型大鼠括約肌異常舒張，胃腸下行運(yùn)動(dòng)亢奮，使腸道內(nèi)容物停留時(shí)間減少，腸道對(duì)于內(nèi)容物水分重吸收不充分，導(dǎo)致模型大鼠糞便含水量異常增多。

D-木糖主要在空腸上段被吸收，不能為肝臟利用，大部分經(jīng)由腎臟從尿液中排出，尿液中木糖排泄率可反應(yīng)小腸吸收能力，是目前臨床脾虛證的常用診斷指標(biāo)之一［9］。造模結(jié)束后，除空白組外各組大鼠D-木糖排泄率顯著降低，提示模型復(fù)制成功。藥物干預(yù)后，給藥組大鼠D-木糖排泄率顯著上升，提示其腸道吸收功能有所改善。

水通道蛋白AQP3 主要在消化道中表達(dá)，主要調(diào)節(jié)消化道的水分重吸收功能，直接影響消化道對(duì)水的重吸收功能。結(jié)腸AQP3 表達(dá)過低會(huì)影響結(jié)腸對(duì)內(nèi)容物或糞便水分的重吸收，糞便含水量過高從而導(dǎo)致腹瀉［10］。AQP2 主要分布于腎臟中，調(diào)節(jié)腎臟對(duì)原尿水分的重吸收功能［11］。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠結(jié)腸AQP3 水平顯著降低，表明其結(jié)腸水分重吸收功能異常。實(shí)驗(yàn)中收集大鼠尿液時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)造模干預(yù)的鼠尿量較空白組少，經(jīng)過給藥干預(yù)后，膏方組和陽性藥組大鼠尿量有所上升，但仍較空白組低，且組內(nèi)尿量差異大，猜測可能是由于糞便含水量上升，大鼠自身為達(dá)到機(jī)體水液平衡做出的調(diào)整。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明模型組大鼠的腎臟AQP2 水平顯著升高，表明其腎臟對(duì)水的重吸收作用加強(qiáng)，因此導(dǎo)致尿量較少。經(jīng)藥物干預(yù)后，給藥組腎臟AQP2 水平降低，結(jié)腸AQP3 水平上升。本實(shí)驗(yàn)初步從機(jī)體水鹽代謝角度探究膏方對(duì)大鼠模型的治療作用，僅僅用ELISA 法對(duì)比各組大鼠結(jié)腸AQP3 和腎臟AQP2 的數(shù)量差異，較為片面，結(jié)果也存在較大誤差，是本實(shí)驗(yàn)的不足之處。

Occludin 和Claudin-1 均是腸屏障結(jié)構(gòu)的重要緊密連接蛋白，功能為維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，控制相關(guān)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持和調(diào)節(jié)腸道通透性［12］。實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠結(jié)腸Occludin 和Claudin-1 蛋白水平降低，腸道通透性增加，可能是導(dǎo)致糞便含水量上升的主要原因，經(jīng)藥物干預(yù)后，膏方組大鼠結(jié)腸Occludin 和Claudin-1 蛋白水平有所上升。

實(shí)驗(yàn)中模型大鼠胃腸激素、水通道蛋白和結(jié)腸Occludin 和Claudin-1 蛋白表達(dá)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道一致，經(jīng)藥物干預(yù)后，健脾祛濕膏組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)有所改善，提示健脾祛濕膏可能是通過上調(diào)MTL 水平，同時(shí)下調(diào)SS 和VIP水平，改善脾虛腹瀉大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)和吸收能力，同時(shí)上調(diào)結(jié)腸AQP3、Occludin 和Claudin-1 蛋白水平，下調(diào)腎臟AQP2 水平，改善腸道的通透性和對(duì)水的重吸收能力，調(diào)整機(jī)體水鹽平衡，緩解腹瀉癥狀，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)療效。