陳 歡，姜媛媛?，徐 峰，張 利，胡 佳，吳金勇，王海平

（1.四川農(nóng)業(yè)大學理學院，四川雅安 625014；2.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都 611731）

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，具有祛風止痛、活血祛瘀的功效［1］，富含多糖、生物堿、揮發(fā)油、內(nèi)酯等多種化學成分，廣泛應用于心血管疾病的預防與治療［2］。多糖作為川芎主要活性成分之一，主要由木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖組成［3］，具有抗菌、抗氧化、抑制肝癌細胞HepG2 增殖［4］等活性，目前已成為研究熱點，具有開發(fā)利用的潛力。

多酚、黃酮、花青素、多糖［5］等天然活性成分在清除自由基、防止生物體內(nèi)過氧化中發(fā)揮重要作用，可作為潛在的新型天然抗氧化劑。多糖生物活性與其分子結(jié)構(gòu)、水溶性、分子量、黏度等性質(zhì)密切相關(guān)［6］，主要受樣品處理方法、提取工藝、干燥方式等因素的影響［7］，其特征結(jié)構(gòu)的破壞可能會導致其生物活性顯著下降。目前，多糖制備過程中常用的干燥方式有冷凍干燥、真空干燥、熱風干燥，其中熱風干燥在食品工業(yè)中應用最廣泛，成本也最低廉，但在高溫有氧條件下會破壞多糖品質(zhì)和活性；真空干燥在除去水分的同時可防止多糖與氧氣結(jié)合而發(fā)生氧化，但生產(chǎn)效率低；冷凍干燥通過升華除去物質(zhì)中水分，在低溫缺氧條件下可抑制微生物生長、酶反應，從而生產(chǎn)出高品質(zhì)多糖。目前，對川芎多糖的研究主要集中在提取、分離、純化、活性等方面，但尚無干燥方式對該成分理化性質(zhì)、抗氧化活性影響的報道。

因此，本實驗比較熱風干燥、真空干燥、冷凍干燥所得川芎多糖在理化性質(zhì)、抗氧化活性方面的差異，進而探討不同干燥方式對該成分理化性質(zhì)、抗氧化活性的影響，為其進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 川芎采自四川綿竹川芎高效種植示范基地，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院楊瑞武教授鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.，洗凈后50 ℃下烘干，粉碎，過60 目篩，干燥保存。

1.2 試劑與藥物 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、四唑氮藍（NBT）、還原型輔酶I 鈉鹽（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）均為分析純，購于美國Sigma-Aldrich 公司。葡萄糖、苯酚、無水乙醇均為分析純，濃硫酸為優(yōu)級純，購于成都市科龍化工試劑有限公司。

1.3 儀器 CP-114 電子天平，購于上海洪紀儀器設備有限公司；SB-600DTD 超聲波清洗機，購于寧波新芝生物科技股份有限公司；透析袋（截留分子量8 000 Da），購于成都市科龍化工試劑有限公司；LGJ-12 冷凍干燥機，購于北京松源華興科技發(fā)展有限公司；GL-22MS 高速冷凍離心機，購于匡貝實業(yè)有限公司；DZ-2BC 真空干燥箱，購于天津泰斯特儀器有限公司；DGZ-9240 電熱恒溫鼓風干燥箱，購于上海一恒科技有限公司；FTIR-8400S 紅外光譜儀，購于日本Shimadzu 公司。

2 方法

2.1 川芎多糖制備 采用超聲波聯(lián)合熱水浸提法提取多糖。準確稱取50 g 藥材粉末，置于圓底燒瓶中，以1∶16料液比加水，超聲（40 kHz、200 W）處理17 min，置于60 ℃恒溫水浴中提取4.3 h，提取液真空濃縮后Sevage 法脫蛋白，蒸餾水透析48 h，透析液真空濃縮至原體積的1／10，4 倍量乙醇沉淀，離心后收集沉淀，分別采用熱風干燥（60 ℃）、真空干燥（60 ℃，0.06 MPa）、冷凍干燥（-40 ℃，100 Pa）干燥至含水量小于10%［8］，即得，計算得率，公式為得率＝粗多糖質(zhì)量／藥材粉末質(zhì)量×100%。

2.2 含水量測定 準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各1 g 至稱量瓶中，置于120 ℃恒溫干燥箱中干燥2 h。移入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，反復稱定質(zhì)量至恒重，計算含水量，公式為含水量＝ ［（M1-M2）／（M1-M0）］×100%。其中，M0為稱量瓶質(zhì)量（g），M1為干燥前多糖、稱量瓶總質(zhì)量（g），M2為干燥后多糖、稱量瓶總質(zhì)量（g）。

2.3 總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)含量測定

2.3.1 總糖 采用苯酚-硫酸法［9］。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝5.535X+0.202 5（R2＝0.998 0），在0.005～0.05 mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 糖醛酸 采用硫酸-咔唑法［10］。以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝3.405X-0.061 3（R2＝0.999 0），在0.02～0.1 mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 蛋白質(zhì) 采用考馬斯亮藍G-250 法［11］。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝5.165X-0.025 3（R2＝0.999 0），在0.02～0.1 mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 淀粉、酚羥基鑒定 采用I2-KI 試驗鑒定淀粉，F(xiàn)eCl3顯色反應鑒定酚羥基。

2.5 紅外光譜分析 準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各2 mg，加入100 mg KBr 充分研磨，壓片，置于FTIR中，在4 000～450 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，觀察譜峰［12］。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH 自由基清除能力 參照Hu 等［13］報道的方法。準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各0.3 g，制成0～3.0 mg／mL 樣品溶液，與2 mL DPPH 乙醇溶液（0.2 mmol／L）混合，室溫下暗處反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度，重復3 次，取平均值，計算清除率，公式為清除率＝ ［（A對照-A樣品）／A對照］×100%。其中，A對照為蒸餾水替代樣品溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液或維生素C 溶液的吸光度。

2.6.2 羥基自由基清除能力 參照Hao 等［14］報道的方法。準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各0.4 g，制成0～4.0 mg／mL 樣品溶液，依次加入1.5 mmol／L 鄰二氮菲溶液1.0 mL、0.2 mol／L 磷酸鹽緩沖溶液（pH ＝7.4）2.0 mL、1.5 mmol／L 硫酸亞鐵溶液1.0 mL、樣品溶液1.0 mL、0.01% H2O2溶液1.0 mL，在37 ℃恒溫下水浴1 h，于536 nm 波長處測定吸光度，重復3 次，取平均值，計算清除率，公式為清除率＝ ［（A樣品-A空白）／（A對照-A空白）］×100%。其中，A對照為蒸餾水替代樣品溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液或維生素C 溶液的吸光度，A空白為不加雙氧水的混合反應溶液的吸光度。

2.6.3 超氧陰離子清除能力 參照Xu 等［15］報道的方法，采用氮藍四唑（NBT）法測定。準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各0.3 g，制成0～3.0 mg／mL 樣品溶液，加入樣品溶液1.5 mL、300 μmol／L NBT 溶液0.50 mL、468 μmol／L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型輔酶Ⅰ（NADH）溶液0.50 mL、60 μmol／L 過硫酸氫鉀（PMS）溶液0.50 mL，在25 ℃下恒溫5 min，于700 nm 波長處測定吸光度，0.15 mol／L PBS 溶液（pH ＝7.6）代替樣品溶液作為空白對照，重復3 次，取平均值，計算清除率，公式為清除率＝ ［（A對照-A樣品）／A對照］×100%。其中，A樣品為樣品溶液或維生素C 溶液的吸光度，A對照為PBS 溶液的吸光度。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 不同干燥方式對川芎多糖理化性質(zhì)的影響

3.1.1 外觀色澤、成分組成 表1 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖均為淡黃色固體，無臭無味，KI、FeCI3反應均呈陰性，表明均為不含酚類的非淀粉類多糖；冷凍干燥下多糖得率顯著高于真空、熱風干燥下（P＜0.05），并且總糖含量最高，而熱風干燥下總糖含量最低；多糖均含有一定量糖醛酸、蛋白質(zhì)，表明均含有少量蛋白質(zhì)的酸性成分；真空干燥下多糖糖醛酸含量最高，冷凍干燥下最低，熱風、冷凍干燥下無明顯差異（P＞0.05）；冷凍干燥下蛋白質(zhì)含量高于熱風、真空干燥下（P＜0.05）。

表1 不同干燥方式對川芎多糖理化性質(zhì)的影響（）

表1 不同干燥方式對川芎多糖理化性質(zhì)的影響（）

注：同一列不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.1.2 紅外光譜 圖1 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖都有明顯特征吸收，其中3 353 cm-1附近的寬峰是由O-H 伸縮振動吸收產(chǎn)生，表明存在分子間氫鍵；2 925 cm-1附近為C-H 伸縮振動吸收峰［16］；在1 735 cm-1處的吸收為羰基-C＝O 的伸縮振動吸收峰；在1 640 cm-1處的吸收峰是由-OH 的彎曲振動產(chǎn)生；1 410 cm-1附近為-CH2的變形吸收峰；1 024 cm-1附近的吸收峰是由吡喃糖環(huán)醚鍵（C-O-C）、醇羥基的變角振動產(chǎn)生［17］；930 cm-1附近的吸收峰為吡喃環(huán)振動的特征吸收；在870 cm-1處為β-糖苷鍵的吸收峰，表明川芎多糖由β-吡喃糖苷鍵連接。

圖1 川芎多糖紅外光譜圖

3.2 不同干燥方式對川芎多糖抗氧化活性的影響

3.2.1 DPPH 自由基清除能力 圖2 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖對DPPH 自由基的清除率均隨其質(zhì)量濃度（0～3.0 mg／mL）增加而逐漸升高，分別達到76.32%、80.74%、85.29%；當多糖質(zhì)量濃度小于2.0 mg／mL 時，其清除率上升較快，而在2.0～3.0 mg／mL 時上升程度較平緩；3 種干燥方式下IC50分別為1.71、1.58、1.37 mg／mL，表明冷凍干燥多糖清除DPPH 自由基的能力強于熱風、真空干燥。

3.2.2 羥基自由基清除能力 圖3 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖對羥基自由基的清除率均隨其質(zhì)量濃度增加而升高，IC50分別為3.01、2.91、2.74 mg／mL；當多糖質(zhì)量濃度為4.0 mg／mL 時，3 種干燥方式下清除率分別達64.81%、67.23%、71.48%，表明冷凍干燥多糖對羥基自由基的清除能力最強。

圖2 川芎多糖對DPPH 自由基的清除率

圖3 川芎多糖對羥基自由基的清除率

3.2.3 超氧陰離子清除能力 圖4 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖對超氧陰離子的清除率均隨其質(zhì)量濃度（0～3.0 mg／mL）增加而升高，清除率分別達55.65%、52.72%、58.89%；當多糖質(zhì)量濃度小于2.0 mg／mL 時，清除率上升較快，而在2.0～3.0 mg／mL 時上升程度較平緩；3種干燥方式下IC50值分別為3.15、3.38、2.71 mg／mL，表明冷凍干燥多糖對超氧陰離子的清除能力最強。

4 討論與結(jié)論

多糖是具有多種生物活性的天然高分子化合物，其抗氧化活性、理化性質(zhì)與空間構(gòu)象有關(guān)［18］，而干燥方式作為該成分制備過程中的一個重要環(huán)節(jié)，可通過影響其理化性質(zhì)而進一步影響其生物活性［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥、真空干燥、熱風干燥所得川芎多糖在外觀色澤、氣味方面無差異，均不含淀粉、酚類；冷凍干燥下總糖含量最高，熱風干燥下最低；真空干燥下糖醛酸含量最高，其他2 種方法下無明顯差異；冷凍干燥下蛋白質(zhì)含量最高，明顯高于真空、熱風干燥下。段夢穎等［20］發(fā)現(xiàn)，干燥方式對聚合草多糖理化性質(zhì)有顯著影響，其中冷凍干燥總糖含量最高。

圖4 川芎多糖對超氧陰離子的清除率

研究表明，多糖中的-OH、-COOH、-C ＝O 等官能團均與其抗氧化活性有關(guān)［24］。本實驗發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥下總糖含量顯著高于真空、熱風干燥下，其較高的抗氧化活性可能與含有更多-OH、-C＝O 官能團有關(guān)。另外，多糖對自由基清除能力的強弱還與其所含蛋白質(zhì)含量有關(guān)，其中的氨基酸可與羥基自由基相互作用，形成穩(wěn)定的大分子自由基，從而達到清除自由基的效果［25］。但高溫等外界條件會導致糖結(jié)合蛋白變性，可能會引起多糖構(gòu)象受損，進而使其清除自由基活性降低［19］，由于真空、熱風干燥所需溫度較高，可能會導致多糖中結(jié)合蛋白變性，從而降低其抗氧化活性。喻俊等［22］發(fā)現(xiàn)，與熱風、真空干燥比較，冷凍干燥下牛蒡多糖中蛋白質(zhì)含量最高，抗氧化活性最強；Yang等［26］報道，超聲波輔助亞臨界水提取枸杞多糖中較高的蛋白質(zhì)含量可能增強其抗氧化活性。另外，多糖結(jié)構(gòu)上連接的糖醛酸可與蛋白質(zhì)等其他成分結(jié)合起來，從而呈現(xiàn)各種活性［18］。本實驗發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥下抗氧化活性較強，可能與其含有較高總糖、蛋白質(zhì)含量有關(guān)，同時糖醛酸會與部分蛋白質(zhì)結(jié)合，進一步增強該活性。但也有研究指出，多糖抗氧化活性還與其分子量、三螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)［27］，故川芎多糖抗氧化活性的機制還有待進一步研究。

熱風、真空、冷凍干燥所得川芎多糖均為無臭無味的淡黃色固體，是不含多酚類的非淀粉類多糖。其中，冷凍干燥下總糖、蛋白質(zhì)含量最高，分別為（87.72±1.45）%、（1.59±0.17）%；真空干燥下糖醛酸含量最高，為（2.66±0.09）%；3 種干燥方式下川芎多糖均具有較強的體外抗氧化活性，由高到低依次為冷凍干燥、真空干燥、熱風干燥。

綜上所述，川芎多糖具較強的抗氧化活性，今后可加強該成分在畜牧飼料中的應用研究。同時，冷凍干燥可作為制備優(yōu)質(zhì)功能性川芎多糖較好的干燥方式。