劉 霞龍雨青曾 娟李 燦郎培蕾劉湘丹 周日寶?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410208；2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410208）

黃花石蒜Lycoris aureaHerb.，又名忽地笑，生長在陰暗潮濕的斜坡和石縫中，為石蒜科石蒜屬多年生草本植物［1-2］。具有解毒消腫、止咳祛痰、利尿、催吐的功效，可用于咽喉腫痛、癰腫瘡毒、疔瘡結(jié)核、小便不利、水腫、燙火傷、食物中毒、毒蛇咬傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等［3-4］。黃花石蒜中主要的藥用成分為生物堿類，包括石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏等，具有極高的藥用價值［5］。其中，石蒜堿是一種芐基苯乙胺類生物堿，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗瘧疾、鎮(zhèn)痛、保護(hù)心血管等作用［6-9］，在臨床上多用于小兒麻痹后遺癥的治療；加蘭他敏為含有3 個光學(xué)活性碳原子的芐基苯乙胺類生物堿，具有可逆性和選擇性抑制乙酰膽堿酯酶（ACHE）及調(diào)節(jié)煙堿型乙酰膽堿受體的雙重作用，可改善認(rèn)知和記憶功能，有助于治療輕、中及重度阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），還可以用于治療逆轉(zhuǎn)神經(jīng)肌肉阻滯、重癥肌無力和小兒麻痹后遺癥等疾病［10-12］；力可拉敏為加蘭他敏的二氫衍生物，與加蘭他敏有相似的藥理作用，具有抑制膽堿酯酶作用，可以治療小兒麻痹后遺癥、重癥肌無力、外傷性截癱等，且毒性小于加蘭他敏［13］。

文獻(xiàn)資料表明，黃花石蒜鱗莖中加蘭他敏等生物堿含量豐富。目前國內(nèi)工廠生產(chǎn)加蘭他敏等生物堿大都選用黃花石蒜地下鱗莖，鱗莖為一次收益不可再生，致使黃花石蒜不能循環(huán)采收，過度采挖導(dǎo)致野生資源匱乏。隨著臨床用藥量逐年增加，僅憑依賴挖掘野生資源、擴(kuò)大黃花石蒜植物的種植面積等方法來獲取加蘭他敏已不能滿足臨床需求［14］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，不同部位中加蘭他敏含量存在差異，在花中最高［15-16］。因此，進(jìn)行擴(kuò)大用藥部位研究存在可行性。

2020 年版《中國藥典》 一部未收載黃花石蒜，沒有含量測定項(xiàng)，難以整體控制藥材質(zhì)量。而HPLC 法具有高效、靈敏度高、操作簡便、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。近年來，采用HPLC 法研究石蒜科加蘭他敏單一成分的報(bào)道逐漸增多［17-18］，對石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏三者的同時測定研究較少，且存在分離效果不佳的缺點(diǎn)。而對瀏陽市大圍山黃花石蒜不同花期不同部位中3 種生物堿同時測定尚未見報(bào)道。因此，本研究采用HPLC 法對大圍山野生黃花石蒜不同花期不同部位石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏的含量進(jìn)行測定，改進(jìn)提取方法及其洗脫條件，建立有效分離的液相條件，以期為后續(xù)黃花石蒜人工栽培及合理開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 LC 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；JY3002 電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；DZKW-S-6 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；Eco-S15 和泰超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）；SB25-12DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；予華牌循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；LG-08A 型高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市百信藥機(jī)器械廠）；101-3AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 石蒜堿（批號R17M9F61708）、加蘭他敏（批號Y28S6Y17770）、力可拉敏（批號W10M10Z87843）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。甲醇為色譜純；氨水、氫氧化鈉、磷酸、乙酸乙酯均為分析純；蒸餾水、超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

黃花石蒜于2018 年7 月采自湖南省瀏陽市大圍山，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授鑒定為石蒜科石蒜屬黃花石蒜Lycoris aureaHerb.。將黃花石蒜花蕾期不同部位（全花、花葶、鱗莖）及盛開期不同部位（全花、花被、雄蕊、雌蕊、子房、花梗、不定根、花葶、鱗莖）于60 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過60 目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Supersil ODS-B C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10% A；10～15 min，10%～40% A；15～20 min，40% A；20～23 min，40%～10% A；23～28 min，10% A）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長6～10 min，230 nm；0～6、10～28 min，289 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏對照品12、6、3 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解，加入100 μL 氨水，甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得質(zhì)量濃度分別為1.2、0.6、0.3 mg／mL 的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末0.5 g，精密稱定，置離心管中，加1.0 mL10% 氫氧化鈉溶液堿化15 min，加15 mL 乙酸乙酯室溫下超聲60 min，過濾后55 ℃水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，加?00 μL 氨水，甲醇定容至10 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取供試品、混合對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)樣品中石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏色譜峰與其他峰能達(dá)到基線分離，分離度良好。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下3 種溶液各3 mL，置于10 mL 量瓶中稀釋并定容至刻度，加甲醇氨水溶液制成貯備液并稀釋，精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，測得石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏峰面積RSD 分別為1.78%、1.55%、1.54%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣，測得石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏峰面積RSD分別為2.37%、1.36%、0.88%（n＝6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材粉末0.5 g，平行6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，測得石蒜堿、加蘭他敏、力可拉敏含量RSD 分別為1.40%、2.27%、2.31%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取生物堿含量已知的藥材粉末0.25 g，平行6 份，加等量對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.5 樣品含量測定 按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

由此可知，花蕾期不同部位中力可拉敏含量為0.004 5%～0.025 1%，全花中含量最高，鱗莖中含量最低，前者約為后者的5.58 倍；加蘭他敏含量為0.023 8%～0.124 2%，全花中含量最高，鱗莖中含量最低，前者約為后者的5.22 倍；石蒜堿含量為0.138 9%～0.306 2%，全花中含量最高，花葶中含量最低，前者約為后者的2.20 倍。盛開期不同部位中加蘭他敏含量為0.015 4%～0.179 7%，全花中含量最高，鱗莖中含量最低，前者約為后者的的11.67 倍；力可拉敏含量為0.006 5%～0.035 8%，全花中含量最高，花葶中含量最低，前者約為后者的5.51 倍；石蒜堿含量為0.153 9%～0.500 6%，子房中含量最高，鱗莖中含量最低，前者約為后者的3.25 倍。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含量測定結(jié)果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n＝3）

3 討論

3.1 前處理方法優(yōu)化 對水、甲醇、無水乙醇、75%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等不同溶劑進(jìn)行了提取效果的比較。結(jié)果表明，極性較小的乙酸乙酯、二氯甲烷提取物雜質(zhì)較少且所提石蒜堿、加蘭他敏及力可拉敏提取率較高，分離度佳，故采用乙酸乙酯溶劑提取3 種生物堿。

對比回流提取法［19］、離心處理法、微波提取法［20］、超聲波提取法、酶輔助提取法［21］等多種樣品前處理方法時發(fā)現(xiàn)，它們均存在提取時間長、步驟復(fù)雜、易破壞有效成分、有機(jī)溶劑用量大等缺點(diǎn)。堿化-有機(jī)溶劑提取法［22-23］簡單易行、提取溶劑較少，提取效率最高，效果良好。

3.2 色譜條件優(yōu)化 使用紫外檢測器在200～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收全波長掃描，結(jié)果加蘭他敏、力可拉敏最大吸收波長均為230 nm，石蒜堿最大吸收波長為289 nm，因此本研究選擇230、289 nm 進(jìn)行雙波長檢測。先后考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1% 磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸鹽緩沖液、甲醇-0.9% 三乙胺溶液。最終選用甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，3 種生物堿均在10 min 內(nèi)出峰，在保證整體出峰效率的同時，石蒜堿、加蘭他敏及力可拉敏與其他物質(zhì)分離效果良好，峰形較好，出峰時間較短，且方法學(xué)穩(wěn)定。

3.3 3 種生物堿含量比較 黃花石蒜不同花期不同部位中生物堿的含量具有明顯差異，花蕾期不同部位石蒜堿的含量為全花＞鱗莖＞花葶；加蘭他敏、力可拉敏的含量均為全花＞花葶＞鱗莖。盛開期不同部位石蒜堿的含量為子房＞全花＞花梗＞花被＞雄蕊＞雌蕊＞不定根＞花葶＞鱗莖；加蘭他敏的含量為全花＞子房＞花被＞雄蕊＞雌蕊＞花梗＞不定根＞花葶＞鱗莖；力可拉敏的含量順序?yàn)槿ǎ咀臃浚净ū唬静欢ǜ拘廴铮敬迫铮净ü＃诀[莖＞花葶。

結(jié)果表明同花期同部位3 種生物堿含量以石蒜堿最高，加蘭他敏次之，力可拉敏最低；不同花期相同部位3 種生物堿的含量均呈現(xiàn)盛開期高于花蕾期的規(guī)律；同花期不同部位石蒜堿、加蘭他敏及力可拉敏的含量積累差異明顯，且這3 種生物堿的含量主要富集于花中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)入藥部位鱗莖。采用花部位替代鱗莖作為提取加蘭他敏等生物堿原料，具有可多年反復(fù)采收，保證野生植株的可持續(xù)利用，降低了生產(chǎn)成本及時間成本的優(yōu)點(diǎn)。后續(xù)研究或生產(chǎn)中可考慮花部位替代鱗莖作為提取原料，具有更廣闊的應(yīng)用前景。