游景瑞 孫 佳蘭燕宇李勇軍王永林劉春花?

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004）

毛大丁草為菊科植物毛大丁草Gerbera piloselloides（Linn.）Cass.的干燥全草，是西南地區(qū)少數(shù)民族用藥，具有宣肺止咳、發(fā)汗利水、行氣活血的功效，常用于治療傷風(fēng)咳嗽、哮喘、癰癤等疾?。?-4］。目前，對(duì)毛大丁草的研究主要集中在成分的分離提取上［5-7］，已從其不同部位分離得到香豆素類、黃酮類、有機(jī)酸等83 個(gè)化合物［8-9］，可能是其活性物質(zhì)［10-11］，具有鎮(zhèn)咳、平喘、抗菌、抗腫瘤等藥理作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景［12-14］，但成分含量測(cè)定方法比較單一，如采用RP-HPLC 法、雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定熊果苷含量［15-16］，HPLC 法同時(shí)測(cè)定大丁苷、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素含量［17］，以及對(duì)總黃酮含量的測(cè)定［18］，基于多成分含量同時(shí)測(cè)定的研究尚未見報(bào)道。目前，毛大丁草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍不完善，不能較全面地控制其內(nèi)在質(zhì)量。課題組前期已經(jīng)建立毛大丁草的指紋圖譜，并指認(rèn)出熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 等成分［19］；本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-PDA 法同時(shí)測(cè)定毛大丁草中6 種成分的含量，以期為其質(zhì)量控制方法的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Nexera-i LC-2040C 3D CN 超高效液相色譜儀（UHPLC），包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、脫氣器和光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器（日本島津公司）；EL204 電子天平［萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 熊果苷對(duì)照品（批號(hào)wkq19031511，純度＞98%）購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；綠原酸（批號(hào)170510，純度＞98%）購(gòu)于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；木犀草苷（批號(hào)wkq19013011，純度＞98%）購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；異綠原酸A（批號(hào)AF8112193，純度＞98%）、異綠原酸B（批號(hào)AF7080124，純度＞98%）、異綠原酸C（批號(hào)AF9060921，純度＞98%）購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司。

甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、乙腈（色譜純）均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（色譜純）購(gòu)于美國(guó)Tedia 公司。毛大丁草由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)與生藥學(xué)教研室張旭副教授鑒定為毛大丁草Gerbera piloselloides（Linn.）Cass.的干燥全草。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質(zhì)量濃度分別為1.423 0、0.976 1、0.975 1、0.991 8、0.974 1、1.009 4 mg／mL 的貯備液，經(jīng)稀釋后置同一10 mL量瓶中，30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質(zhì)量濃度分別為284.59、19.52、19.50、19.84、38.96、20.19 μg／mL 的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液 取藥材粉末（過3 號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液5 mL 至25 mL 量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，2% A；3～4 min，2%～10% A；4～7.5 min，10% A；10～13 min，15%～17% A；13～18 min，17% A；18～23 min，17%～28% A；23～25 min，28%～50% A；25～30 min，50%～53% A；30～32 min，53%～95% A；32～33 min，95% A）；體積流量0.28 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)280、328 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品、供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1，可知6 種成分的分離度良好（均＞1.5），雜質(zhì)干擾小，可用于含量測(cè)定。

圖1 各成分UHPLC 色譜圖Fig.1 UHPLC chromatograms of various constituents

3.1.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（溶液①），精密吸取5 mL 置于10 mL量瓶中，30%甲醇定容至刻度，搖勻得溶液②，同法制備溶液③④⑤⑥，稀釋成6 個(gè)質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取上述混合對(duì)照品溶液，成比例稀釋后進(jìn)樣分析，按S／N ＝10、S／N ＝3 分別計(jì)算定量限（LOQ）、檢出限（LOD），結(jié)果見表1。

3.1.3 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.52%、0.13%、0.95%、0.27%、0.30%、0.34，表明儀器精密度良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材6 份，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C含量RSD 分別為0.90%、1.63%、1.61%、1.31%、1.55%、1.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD分別為0.27%、0.19%、0.41%、0.31%、0.18%、0.34%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的樣品0.25 g，共9 份，置100 mL 具塞錐形瓶中，分別加入50%、100%、150%水平的對(duì)照品各3 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果，熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 平均加樣回收率分別為102.06%、103.37%、104.97%、104.79%、105.21%、104.75%，RSD 分別為1.88%、1.70%、1.20%、1.89%、1.53%、1.25%。

3.1.7 樣品含量測(cè)定 收集不同產(chǎn)地藥材，對(duì)熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。由此可知，6 種成分總含量為1.165 8%～7.244 4%，其中熊果苷平均含量最高，異綠原酸A 次之，最低的是木犀草苷。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果（%， n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents（%， n＝2）

3.1.8 聚類分析和主成分分析 采用SPSS 22.0軟件，以6 種成分含量為變量，對(duì)30 批藥材進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間連接法，以歐氏平方距離為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見圖2。30 批樣品可分成4 類，第一類是S11（貴州凱里），第二類是S19（貴州貞豐）、S28（云南文山）、S29（云南），第三類是S1（貴州貴陽）、S7（貴州貴陽）、S9（貴州凱里）、S14（貴州都勻）、S16（貴州盤縣）、S20（四川）、S22（廣西）、S25（云南）、S26（云南）、S27（云南），其他16 批為第四類。

圖2 30 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of thirty batches of samples

采用SPSS 22.0 軟件，以6 種成分含量為變量進(jìn)行主成分分析，首先對(duì)變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后計(jì)算特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率。第一主成分的特征值是4.541，累積貢獻(xiàn)率為75.675%；第二主成分的特征值是0.721，累積貢獻(xiàn)率為12.014%，前兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為87.69% ＞85%，即占毛大丁草藥材中6 種成分信息含量的87.69%，因此可選擇其進(jìn)行評(píng)價(jià)。第一主成分反映了熊果苷、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的信息，而第二主成分反映了木犀草苷的信息，見表3～4。

表3 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率Tab.3 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表4 相關(guān)矩陣Tab.4 Correlation matrices

根據(jù)主成分分析結(jié)果，對(duì)6 種成分的含量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，計(jì)算主成分得分和綜合得分，利用主成分矩陣得到得分系數(shù)矩陣，表達(dá)式如下。

Prin 1 ＝0.403 1X1+0.442 5X2+0.296 1X3+0.424 2X4+0.422 8X5+0.441 1X6

Prin 2 ＝-0.199 0X1+0.087 1X2+0.892 7X3-0.328 6X4+0.025 9X5-0.215 5X6

由此可知，第一主成分方差貢獻(xiàn)率最大，包含最多的信息，最大系數(shù)是X2，表明綠原酸含量在質(zhì)量控制中起到了比較重要的作用。綜合評(píng)價(jià)函數(shù)F＝0.756 75F1+0.120 14F2，再計(jì)算30 批樣品的綜合得分和排序，見表5。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同提取溶劑（乙醇、甲醇、30%甲醇、50% 甲醇、70% 甲醇）、提取方式（超聲、回流、索氏）和提取時(shí)間（1、2、3 h），結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%甲醇作為溶劑，加熱回流提取2 h 效率最高，雜質(zhì)最少。

分別考察了不同流動(dòng)相系統(tǒng)，包括甲醇-水、乙腈-水，發(fā)現(xiàn)后者分離效果較好。同時(shí)考察了不同流動(dòng)相pH（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%冰醋酸水、乙腈-0.1% 甲酸水）、不同色譜柱、不同體積流量、不同柱溫和不同進(jìn)樣量等，最終選擇“2.2”項(xiàng)下條件。

表5 主成分得分、綜合得分排序Tab.5 Ranks of principal component scores and comprehensive scores

毛大丁草含有多種化學(xué)成分，主要有酚酸類、黃酮類等，均具有明顯的生物活性［20-23］，本研究發(fā)現(xiàn)，6 種成分中熊果苷含量最高，木犀草苷最低，提示熊果苷的含量可作為毛大丁草質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。聚類分析結(jié)果表明不同產(chǎn)地之間各成分含量差異較大，且同一地區(qū)藥材質(zhì)量并不統(tǒng)一，可能與不同氣候和不同采收期等因素有關(guān)。主成分分析結(jié)果表明，S11 批樣品的綜合得分為3.223 9，居首位，同時(shí)其綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 等咖啡酰基奎寧酸總含量最高，表明其成分含量較好；而S13 批的綜合得分最低，綠原酸等咖啡酰基奎寧酸總含量也最低，提示綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 等咖啡?；鼘幩岬暮颗c毛大丁草的品質(zhì)可能存在相關(guān)性，且以綠原酸的含量為主。本研究建立了UHPLC-PDA 含量測(cè)定方法，可以同時(shí)對(duì)毛大丁草中6 種成分進(jìn)行定量分析，其中熊果苷、綠原酸的含量在毛大丁草藥材中占重要地位。