張俊卿 李建寬王 妍吉姣姣高建平?

（1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，山西太原 030001）

黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf.var.moesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津的功效，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中作為補(bǔ)益類中藥被廣泛使用［1］。在現(xiàn)代臨床中，黨參常被應(yīng)用于心血管系統(tǒng)［2］、消化系統(tǒng)［3］及呼吸系統(tǒng)疾?。?］等。炎癥反應(yīng)是機(jī)體的一種以防御為主的基本病理過(guò)程，與各系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5-7］。炎癥作為眾多疾病的共性機(jī)制，開展相關(guān)研究或?qū)榧膊〉念A(yù)防、診斷及治療提供新策略。針對(duì)黨參的抗炎活性研究發(fā)現(xiàn)，其石油醚萃取部位抗炎效果顯著［8］；甲醇提取物可顯著抑制炎性介質(zhì)NO 水平和 iNOS 的表達(dá)［9］；輪葉黨參lancemaside A 通過(guò)抑制IKK／NF-κB 通路發(fā)揮抗炎作用［10］，但黨參活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)從潞黨參中分離得到4 個(gè)甾體類化合物，通過(guò)建立體外LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型對(duì)其抗炎活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為其有效物質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 潞黨參購(gòu)于山西省長(zhǎng)治市平順縣，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根，樣品保存于山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室（編號(hào)20170901）。小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號(hào)CL-0190）。

DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)賽默飛世爾Gibco 公司，批號(hào) 8119281）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX 公司，批號(hào)FBSSA00818-1）；L8880 型LPS（批號(hào)1128W031，北京索萊寶科技有限公司）；青霉素鏈霉素混合液（批號(hào)20190320，北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8 試劑盒（批號(hào)N20821，北京全式金公司）；NO 試劑盒（E-BC-K035-M）、IL-6 試劑盒（E-EL-M0044c）、TNF-α 試劑盒（E-EL-M0049），均購(gòu)于武漢Elab-Science 公司。柱層析硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；TLC 硅膠60 F254（德國(guó)Merck 公司）。甲醇、石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷均為分析純。

1.2 儀器 Avance Ⅲ型400 MHz 窄腔液體核磁共振儀（德國(guó)布魯克公司）；GCMS-QP2010 質(zhì)譜儀（日本島津公司）；KDM 型調(diào)溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；A-1000s 型真空水流抽氣機(jī)（上海愛朗儀器有限公司）；DLSB-5／20 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；TH-Ⅱ型數(shù)控薄層顯色加熱器（上海科哲生化有限公司）；HX-01PW 型薄層噴霧器（武漢恒信儀器有限公司）；Goodsee-Ⅰ薄層色譜攝影儀（上?？普苌邢薰荆籇ZF-6020MBE 型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；HF90 型CO2培養(yǎng)箱（Heal Force 力康生物醫(yī)療有限公司）；SW-CJ-2F型潔凈工作臺(tái)（上海博迅醫(yī)療生物儀器公司）；DMi8／DFC45OC 型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；AMR-100 型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）；SC-2546 型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 提取與分離 取干燥潞黨參25 kg，粉碎，甲醇回流提取3 次（分別回流2、1.5、1 h），合并提取液并減壓濃縮，浸膏用水混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，回收溶劑后得石油醚部位0.498 kg、乙酸乙酯部位0.066 kg、正丁醇部位0.356 kg。石油醚部位經(jīng)硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯（70∶1、60∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶2），二氯甲烷-甲醇（40∶1、25∶1、10∶1、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4）梯度洗脫，用薄層色譜（TLC）檢測(cè)合并相似餾分，減壓回收溶劑后得到餾分段Fr.1～Fr.20。Fr.8（5.0 g）經(jīng)硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯（60∶1～10∶1）梯度洗脫，分離得到5 個(gè)餾分Fr.8.1～Fr.8.5。其中，F(xiàn)r.8.4（1.0 g）經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離得到菠甾酮類化合物（1～2，330 mg）；Fr.12（7.0 g）以石油醚-乙酸乙酯（8∶2～6∶4）梯度洗脫，得到6 個(gè)餾分Fr.12.1～Fr.12.6，F(xiàn)r.12.4 進(jìn)行硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（8∶2）洗脫，得到菠甾醇類化合物（3～4，880 mg）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 采用含有10% 胎牛血清、1% 青霉素（1×105U／mL）、鏈霉素（1×105μg／L）的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為37 ℃、5%CO2，待細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%后進(jìn)行細(xì)胞傳代。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，狀態(tài)良好。

2.3 甾體化合物溶液制備及分組 菠甾酮化合物（1～2）和菠甾醇化合物（3～4）均用二甲基亞砜（DMSO）完全溶解制備成質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL母液，再用完全培養(yǎng)基分別稀釋為3 個(gè)質(zhì)量濃度組（1、2、4 μg／mL），使DMSO 最大工作液質(zhì)量濃度在5 μg／mL 以下。

2.4 細(xì)胞炎癥模型建立 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞以1×105／mL 的濃度接種于96 孔板，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入含有不同質(zhì)量濃度LPS 的培養(yǎng)基，并設(shè)置空白組和對(duì)照組，每組6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8 法測(cè)定不同質(zhì)量濃度LPS 對(duì)細(xì)胞活力的影響，Griess 法檢測(cè)其誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)NO 水平，從而確定后續(xù)細(xì)胞炎癥模型中質(zhì)量濃度。

2.5 甾體化合物對(duì)細(xì)胞活力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞用刮刀刮下，加完全培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，濃度調(diào)整至約5×104／mL，按每孔100 μL 將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋的各濃度甾體化合物，每孔100 μL，空白組和對(duì)照組也分別加入等量的培養(yǎng)基，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。利用CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力，在每孔中加入10 μL CCK 試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 下每孔的吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.6 甾體化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 釋放NO水平的影響 分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的RAW264.7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，接種于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后，棄去舊培養(yǎng)液，設(shè)置對(duì)照組、LPS 模型組、甾體化合物+LPS 組（加入含各質(zhì)量濃度化合物的培養(yǎng)基120 μL 預(yù)保護(hù)4 h，吸出含藥培養(yǎng)液，換為含LPS 的培養(yǎng)基120 μL）。每孔終體積均為120 μL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，各處理組均在相同時(shí)間點(diǎn)加入LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔取其細(xì)胞上清液100 μL，依照NO 試劑盒說(shuō)明書的方法，在酶標(biāo)儀550 nm 處測(cè)定OD值，并計(jì)算NO 水平。抑制率＝（1 -NO 濃度藥物組／NO 濃度模型組）×100%。

2.7 甾體化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 分泌炎性因子的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的RAW264.7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，接種于24 孔板，每孔500 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后，棄去舊培養(yǎng)液，設(shè)置空白對(duì)照組、LPS 模型組、甾體化合物+LPS 組（加入含各質(zhì)量濃度化合物的培養(yǎng)基500 μL 預(yù)保護(hù)4 h，吸出含藥培養(yǎng)液，換為含LPS 的培養(yǎng)基500 μL）。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，各處理組均在相同時(shí)間點(diǎn)加入LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集各組每孔細(xì)胞上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取100 μL，用IL-6 和TNF-α Elisa 試劑盒按照說(shuō)明書的方法檢測(cè)炎性因子的含有量。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色結(jié)晶，EI-MSm／z：410，分子式C29H46O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.17（m，1H，H-7），5.12（dd，J＝15.0，8.6 Hz，1H，H-22），5.02（dd，J＝15.2，8.6 Hz，1H，H-23），2.41（td，J＝14.5，5.9 Hz，4H，CH2-2，CH2-4），1.00（s，3H，CH3-19），0.92（d，J＝6.4 Hz，3H，CH3-21），0.84（d，J＝5.2 Hz，3H，CH3-26），0.79（t，J＝6.1 Hz，3H，CH3-29），0.78（d，J＝5.1 Hz，3H，CH3-27），0.55（s，3H，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：211.8（C-3），139.5（C-8），138.0（C-22），129.5（C-23），117.0（C-7），55.8（C-17），55.0（C-14），51.2（C-24），48.8（C-9），44.2（C-4），43.3（C-13），42.8（C-5），40.8（C-20），39.3（C-12），38.7（C-1），38.1（C-2），34.4（C-10），31.8（C-25），30.0（C-6），28.5（C-16），25.4（C-28），23.0（C-15），21.7（C-11），21.3（C-27），21.1（C-21），19.0（C-26），12.4（C-19），12.2（C-29），12.1（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11-12］一致，故鑒定為α-菠甾酮。

化合物2：白色結(jié)晶，EI-MSm／z：412，分子式C29H48O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.17（m，1H，H-7），2.41（td，J＝14.5，5.9 Hz，4H，CH2-2，CH2-4），1.00（s，3H，CH3-19），0.56（s，3H，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：211.8（C-3），139.4（C-8），116.9（C-7），56.0（C-14），54.9（C-17），48.8（C-9），45.8（C-24），44.2（C-4），43.2（C-13），42.8（C-5），39.4（C-12），38.7（C-1），38.1（C-2），36.5（C-20），34.4（C-10），33.8（C-22），30.0（C-6），29.1（C-25），27.9（C-16），26.1（C-23），23.0（C-28），22.9（C-15），21.7（C-11），19.8（C-26），19.0（C-27），18.9（C-21），12.4（C-19），11.9（C-29），11.8（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］一致，故鑒定為22，23-二氫菠菜甾酮。

化合物3：無(wú)色針狀結(jié)晶，EI-MSm／z：412，分子式C29H48O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.14（m，1H，H-7），5.14（dd，J＝15.0，8.0 Hz，1H，H-22），5.01（dd，J＝15.8，8.0 Hz，1H，H-23），3.57（m，1H，H-3），1.01（d，J＝6.6 Hz，3H，CH3-21），0.91（d，J＝6.3 Hz，3H，C-26），0.84（t，J＝6 Hz，3H，CH3-29），0.83（s，3H，CH3-19），0.78（d，J＝5 Hz，3H，C-27），0.53（s，3H，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：139.6（C-8），138.2（C-22），129.4（C-23），117.4（C-7），71.0（C-3），55.9（C-17），55.1（C-14），51.2（C-24），49.4（C-9），43.3（C-13），40.8（C-20），40.2（C-5），39.4（C-12），37.9（C-4），37.1（C-1），34.2（C-10），31.8（C-25），31.4（C-2），29.6（C-6），28.5（C-16），25.4（C-28），23.0（C-15），21.5（C-11），21.4（C-21），21.1（C-26），19.0（C-27），13.0（C-19），12.2（C-29），12.0（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］一致，故鑒定為α-菠甾醇。

化合物4：無(wú)色針狀結(jié)晶，EI-MSm／z：414，分子式C29H50O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.14（m，1H，H-7），3.57（m，1H，H-3），1.01（d，J＝6.6 Hz，3H，CH3-21），0.91（d，J＝6.3 Hz，3H，C-26），0.84（t，J＝6 Hz，3H，CH3-29），0.83（s，3H，CH3-19），0.78（d，J＝5 Hz，3H，C-27），0.53（s，3H，CH3-18）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：139.5（C-8），117.4（C-7），71.0（C-3），56.1（C-17），55.0（C-14），49.4（C-9），45.8（C-24），43.2（C-13），40.2（C-5），39.5（C-12），37.9（C-4），37.1（C-1），36.6（C-20），34.2（C-10），33.9（C-22），31.4（C-2），29.1（C-6），29.1（C-25），27.9（C-16），26.1（C-23），23.0（C-28），22.9（C-15），21.5（C-11），19.8（C-26），19.0（C-27），18.9（C-21），13.0（C-19），11.9（C-29），11.8（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］一致，故鑒定為22，23-二氫菠菜甾醇。

3.2 RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型建立 不同質(zhì)量濃度的LPS 可不同程度地引起細(xì)胞增殖，并濃度依賴性地誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)NO 產(chǎn)生，結(jié)果見圖1。10 ng／mL LPS 組與對(duì)照組比較，其細(xì)胞增殖程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但NO 水平增加（P＜0.01），故選擇其作為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的炎癥模型。

圖1 不同質(zhì)量濃度LPS 對(duì)細(xì)胞活力、NO 水平的影響Fig.1 Effects of different concentrations of LPS on cell viability and level of NO

3.3 甾體化合物對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞活力的影響采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)甾體化合物處理后的細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，菠甾酮化合物（1～2）在質(zhì)量濃度為5 μg／mL 時(shí)細(xì)胞活力稍有下降，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；菠甾醇化合物（3～4）在質(zhì)量濃度5 μg／mL 以下時(shí)均未對(duì)細(xì)胞活力造成影響。因此，后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中甾體化合物質(zhì)量濃度均在5 μg／mL以下，見圖2。

圖2 菠甾酮、菠甾醇對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of spinasteron and spinasterol on the viability of RAW264.7 cells

3.4 甾體化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞釋放NO 水平的影響 與對(duì)照組比較，10 ng／mL LPS 可誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞上清中NO 水平增加（P＜0.01）；藥物預(yù)處理組與模型組比較，藥物組均能顯著抑制細(xì)胞上清中的NO 水平。菠甾酮在1、2、4 μg／mL 質(zhì)量濃度下對(duì)LPS 刺激條件下產(chǎn)生的NO抑制率分別為22.69%、37.23%、46.87%，菠甾醇在1、2、4 μg／mL 質(zhì)量濃度下對(duì)LPS 刺激條件下產(chǎn)生的NO 抑制率分別為11.17%、18.00%、20.31%，見圖3A。菠甾酮能顯著降低細(xì)胞炎癥模型中NO 水平，并呈劑量依賴性，而菠甾醇對(duì)NO水平的抑制活性不呈劑量依賴性。

3.5 甾體化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞分泌IL-6 及TNF-α 的影響 與對(duì)照組比較，LPS 組IL-6、TNF-α 水平均顯著增加。甾體化合物預(yù)處理4 h后，與LPS 組比較，菠甾酮在1、2、4 μg／mL質(zhì)量濃度下IL-6 水平抑制率分別為43.59%、62.23%、88.37%，TNF-α 抑制率分別為34.79%、50.61%、82.48%；菠甾醇在1、2、4 μg／mL質(zhì)量濃度下對(duì)IL-6 水平的抑制率分別為36.82%、49.28%、83.10%，對(duì)TNF-α 水平的抑制率為19.43%、44.64%、72.79%，見圖3B～3C。由此可見，菠甾酮和菠甾醇均可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α 的分泌，并呈濃度依賴關(guān)系，而且相同質(zhì)量濃度下前者活性更強(qiáng)。

圖3 甾體化合物對(duì)NO、IL-6、TNF-α 水平的影響Fig.3 Effect of steroids on levels of NO，IL-6 and TNF-α

4 討論

甾體類是自然界中廣泛存在的一種成分，均具有環(huán)戊烷駢多氫菲的甾體母核。甾體類化合物分類較多，其中植物來(lái)源的甾醇因其具有廣泛的藥理活性被高度關(guān)注，近年大量研究表明植物甾醇具有降血脂［16］、保護(hù)胃黏膜［17］、抗腫瘤［18］、抗炎［19］等作用。對(duì)于植物甾醇的抗炎活性，報(bào)道較多的是β-谷甾醇［20］、巖藻甾醇［21］、α-菠甾醇［22-23］以及麥角甾醇［24］，而對(duì)于其他結(jié)構(gòu)類型的植物甾醇研究相對(duì)較少。本研究分離得到4 個(gè)甾體類化合物中僅α-菠甾醇有相關(guān)抗炎活性的文獻(xiàn)報(bào)道［22-23］。4 個(gè)化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，α-菠甾醇與α-菠甾酮僅在C-3 位上的取代不同（分別為—OH取代和＝O 取代），另外2 個(gè)甾體化合物則分別為α-菠甾醇及α-菠甾酮的C-17 側(cè)鏈中的不飽和雙鍵被氫化。本研究通過(guò)建立體外細(xì)胞炎癥模型，比較了菠甾酮和菠甾醇的抗炎活性，發(fā)現(xiàn)菠甾酮的各項(xiàng)體外抗炎活性指標(biāo)（NO、IL-6、TNF-α）均優(yōu)于菠甾醇，提示C-3 位上的不同取代基可能會(huì)對(duì)甾體化合物的抗炎活性產(chǎn)生一定影響。與菠甾酮比較，菠甾醇對(duì)NO 水平的抑制活性不成濃度依賴性關(guān)系，推測(cè)炎性介質(zhì)NO 的產(chǎn)生可能受甾體結(jié)構(gòu)中C-3 位取代基的影響更大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［25］，LPS 通過(guò)激活MAPK 和NF-κB 信號(hào)途徑刺激誘導(dǎo)型NO 合成酶（iNOS）的合成而催化產(chǎn)生過(guò)量NO 參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，這提示具有不同取代基的甾體化合物可能是對(duì)分泌NO 過(guò)程中的某些途徑產(chǎn)生不同的影響，從而造成NO 水平的差異。這種甾體結(jié)構(gòu)上的差異與發(fā)揮抗炎活性的相關(guān)性研究尚需在今后進(jìn)一步探討。