張雨軒，馬雪蓮，楊漢繼，趙綺悅，高曉萌，許慶友?

（1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北石家莊 050091；2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室，河北石家莊 050091）

我國慢性腎臟病的發(fā)病率不斷上升［1］，由梗阻性腎病導(dǎo)致的腎功能衰竭發(fā)病率也有明顯升高的趨勢。單側(cè)腎梗阻引起慢性腎衰竭的機制尚不明確，前期研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻可誘導(dǎo)健側(cè)腎臟細胞增殖，并隨著時間的延長發(fā)生腎臟纖維化［2］。

近幾年來，中藥復(fù)方、單味藥及提取物在治療腎小球硬化、延緩腎功能衰竭方面取得了許多新進展［3-5］，但對單側(cè)腎臟損傷誘導(dǎo)慢性腎衰竭的干預(yù)機制尚不明確。因此，本實驗觀察補虛解毒化瘀方延緩梗阻性腎病健側(cè)腎小球硬化的作用機制，以期為相關(guān)臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 清潔級Sprague-Dawley 雄性大鼠40 只，4 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購于河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2013-1-003。隨機分為假手術(shù)組、模型組、依普利酮組、中藥組，每組10 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。

1.2 藥物 補虛解毒化瘀方組方藥材為生黃芪20 g，地龍、醋鱉甲、赤芍、黃芩、金銀花各10 g，均通過廣東一方制藥公司制成免煎顆粒。依普利酮購于美國輝瑞制藥公司。飼料經(jīng)美國Research Diets 公司加工，由東京大學(xué)Tatsuo Shimosawa 教授惠贈。

1.3 試劑 誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）抗體（批號GR194781-9）、GAPDH 抗體（批號10494-1-AP）（英國Abcam 公司）；增殖細胞核抗原（PCNA）抗體（單克隆抗體，美國Proteintech 公司，批號10205-2-AP）；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）抗體（批號G58021）、β-Actin 抗體（批號XS20170612031）（美國Bioworld Technology 公司）；免疫組化試劑盒（北京中衫金橋有限公司，批號K186621D）；脫脂奶粉（美國BD 公司，批號8064872）。

1.4 儀器 電泳儀及電泳槽（北京六一公司）；Semi-Day 半干轉(zhuǎn)膜儀（美國 Bio-Rad 公司）；DP72-CCD、BX53 病理圖文拍照系統(tǒng)（日本Olympus 公司）；RM 2245 石蠟切片機（德國Leica上海分公司）；1-15K 高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；近紅外成像掃描儀（美國 LI-COR Biosciences 公司）。

2 方法

2.1 造模 除假手術(shù)組外，其余各組大鼠結(jié)扎單側(cè)輸尿管，水合氯醛麻醉后于左側(cè)中腹部切開，游離左側(cè)輸尿管，分別在腎盂處、輸尿管上1／3 處用絲線結(jié)扎，在結(jié)扎線之間切斷輸尿管，逐層縫合腹壁皮膚［6］；假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎離斷，輕輕撥動腸管后縫合皮膚。術(shù)后1 d，依普利酮組給予含藥混合飼料喂養(yǎng)（100 mg／kg）［7］；中藥組參照《實驗動物學(xué)》［8］給予免煎顆粒，按1.92 g／kg（相當于11.7 g／kg 生藥量）劑量加到3 mL蒸餾水中，每天灌胃1 次。

2.2 標本收集 藥物干預(yù)10 d 后處死大鼠，留取健側(cè)腎臟，一部分腎組織用4%多聚甲醛固定后制備常規(guī)石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色；其余組織于-70 ℃下保存，用于分子生物學(xué)檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 腎組織損傷 大鼠腎組織進行HE 染色后，在普通光鏡下觀察。為了確定腎小球的損傷程度，參照Purkerson 等［9］對腎小球病變組織學(xué)的分級標準分為（1）0 級，無任何病變；（2）Ⅰ級，系膜基質(zhì)增多，伴輕度系膜細胞增生；（3）Ⅱ級，系膜區(qū)擴大明顯，伴血管袢階段硬化和塌陷；（4）Ⅲ級，血管節(jié)段硬化，伴血管袢明顯塌陷；（5）Ⅳ級，腎小球硬化，伴透明病變，每張切片觀察20 個腎小球，歸于上述5 個等級，計算各等級腎小球所占比例，計算病理積分，進行半定量分析。

2.3.2 膠原纖維 大鼠腎組織進行Sirius red 染色后，在普通光鏡下觀察，以紅色膠原沉積為陽性信號。通過Image Proplus 多媒體彩色病理圖像分析軟件進行分析，計算腎小球膠原沉積面積與腎小球總面積的比值，取平均值。

2.3.3 HIF-1α、PCNA 相對表達 采用免疫組織化學(xué)法。HIF-1α 免疫染色評分為陽性細胞范圍與染色強度之和，陽性細胞范圍≤25% 為0 分，26%～50%為1 分，51%～75%為2 分，76%～100%為3 分；染色強度0 分為陰性著色，1 分為淡黃色，2 分為淺褐色，3 分為深褐色，每張切片觀察20 個腎小球并分別計分，PCNA 檢測腎小球陽性細胞占腎小球細胞總數(shù)的比例，進行半定量分析。

2.3.4 HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達 采用免疫蛋白印跡法。提取大鼠腎皮質(zhì)蛋白，BCA 測定濃度后在95 ℃下變性，取30～60 μg 進行SDSPAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，BSA 封閉1 h，加入一抗（1∶200～1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，TBST 清洗3 次，每次8 min，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次8 min，TBS 清洗5 min，紅外激光成像系統(tǒng)掃描，所得結(jié)果以內(nèi)參校正。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較先采用方差分析，再采用Tukey 檢驗（均為雙側(cè)檢驗）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠腎組織病理變化 HE 染色顯示，假手術(shù)組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)無異常，血管袢開放良好；模型組大鼠腎小球體積增大，系膜細胞增殖明顯（P＜0.05）；依普利酮、中藥組大鼠細胞增殖較模型組減輕（P＜0.05）。Sirius red 染色顯示，模型組膠原沉積多于假手術(shù)組（P＜0.05），依普利酮、中藥組膠原沉積更少（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠健側(cè)腎臟病理變化及HIF-1α、PCNA 相對表達（×400）Fig.1 Renal pathological changes and HIF-1α，PCNA relative expressions in contralateral kidneys of rats in various groups（×400）

表1 各組大鼠健側(cè)腎臟膠原沉積（， n＝6）Tab.1 Collagen deposition of contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

表1 各組大鼠健側(cè)腎臟膠原沉積（， n＝6）Tab.1 Collagen deposition of contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.2 大鼠腎組織HIF-1α、PCNA 相對表達 假手術(shù)組大鼠HIF-1α 僅在腎小管呈弱表達，主要見于細胞漿內(nèi)；模型組大鼠HIF-1α 相對表達增強（P＜0.05），可見于腎小管及腎小球，小球內(nèi)大量細胞核著色，呈棕色黃染顆粒；中藥組、依普利酮組大鼠腎小管內(nèi)少量著色，主要表達在細胞漿內(nèi)，HIF-1α 相對表達低于模型組（P＜0.05）。見圖1、表2。

假手術(shù)組大鼠PCNA 陽性細胞較少，可見于腎小管及腎小球；模型組大鼠腎小球陽性細胞增多（P＜0.05）；中藥組、依普利酮組大鼠PCNA 陽性細胞少于模型組（P＜0.05）。見圖1、表3。

表2 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α 相對表達（， n＝6）Tab.2 Relative expressions of HIF-1α in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

表2 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α 相對表達（， n＝6）Tab.2 Relative expressions of HIF-1α in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

表3 各組大鼠健側(cè)腎臟PCNA 相對表達（， n＝6）Tab.3 Relative expressions of PCNA in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

表3 各組大鼠健側(cè)腎臟PCNA 相對表達（， n＝6）Tab.3 Relative expressions of PCNA in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.3 大鼠腎組織HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達 模型組HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達高于假手術(shù)組（P＜0.05），中藥組、依普利酮組三者蛋白表達低于模型組（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達Fig.2 Protein expressions of HIF-1α，TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats

表4 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達（， n＝3）Tab.4 Protein expressions of HIF-1α，TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats（， n＝3）

表4 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達（， n＝3）Tab.4 Protein expressions of HIF-1α，TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats（， n＝3）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

4 討論

大多數(shù)梗阻性腎病如能及時發(fā)現(xiàn)并解除梗阻、引流腎臟尿液，則可部分或完全恢復(fù)，但部分患者腎功能仍然無法恢復(fù)，甚至繼續(xù)惡化，進展為慢性腎衰竭，故健側(cè)腎臟受損可能是發(fā)生該疾病的重要原因。受損的腎臟可以表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，梗阻性腎病以間質(zhì)纖維化關(guān)注主多，而對腎小球尤其是健側(cè)（對側(cè)）腎臟關(guān)注不夠，腎間質(zhì)纖維化的改變與小管上皮細胞、間質(zhì)細胞、浸潤而來的多種炎性細胞相關(guān)，腎小球硬化的主要病理特征為系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)的過度積聚［10］。

大量研究表明，腎小球系膜細胞是導(dǎo)致Ⅰ型膠原等系膜基質(zhì)成分不斷增加的主要效應(yīng)細胞，腎小球固有細胞增殖及細胞外基質(zhì)（ECM）異常積聚是導(dǎo)致腎小球硬化的重要因素，故有效地抑制腎小球細胞增殖對延緩腎小球硬化有重要意義。細胞增殖與增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）密切相關(guān)，后者是一種僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細胞核內(nèi)的酸性蛋白質(zhì)，故其表達增強表明細胞正處于增生狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）與腎小球硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它是一個多功能細胞因子，可促進細胞增殖、調(diào)節(jié)ECM 積聚［10］，被公認為是腎小球硬化的治療靶標［11］。在過去，腎臟缺氧被認為是纖維化過程的結(jié)果而不是誘因，但最近研究表明缺氧可能是腎臟疾病進展的早期潛在的起始事件［12-14］，炎癥反應(yīng)、活性氧（ROS）均可調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達，細胞在增殖過程中消耗大量氧氣也可激活［15］，它是細胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由ɑ、β 亞基組成，可刺激缺氧基因產(chǎn)物的表達，促進腎纖維化和慢性腎病進展［16］，慢性缺氧可通過抑制其降解來增加蛋白累積，從而使其高表達，并可上調(diào)TGF-β1來促進細胞增殖。因此，慢性缺氧可能是引起腎小球硬化的重要原因。

慢性腎臟病根據(jù)其臨床表現(xiàn)和發(fā)病特點，歸屬于中醫(yī)的“水腫”“關(guān)格”“癃閉”等范疇。目前普遍認為，腎小球硬化是虛實夾雜、本虛標實之證，本虛表現(xiàn)為脾腎虧虛，標實表現(xiàn)為瘀血、水腫、濁毒等，正氣虧虛是腎小球硬化的根本原因，瘀血是加重腎小球硬化的重要因素。遵循中醫(yī)“既病防變”理論，在慢性腎臟病的治療過程中不僅要關(guān)注已經(jīng)發(fā)生的疾病，對于尚未發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生但未深入的病變更要重視。對于梗阻性腎病而言，不僅要研究梗阻側(cè)腎臟病變，還要考察對側(cè)腎臟的病理生理變化。

現(xiàn)代研究表明，中藥對防治腎小球硬化有獨特療效。例如，黃芪含藥血清可抑制大鼠系膜細胞增殖［17］，其總皂苷能抑制高糖誘導(dǎo)下系膜細胞的過度增殖［18］；芪歸益腎方可通過調(diào)節(jié)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白來有效延緩單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟纖維化［19］；丹參注射液可下調(diào)TGF-β1表達，提高活性氧水平，延緩腎小球硬化［20］；地龍能通過抗氧化等途徑抑制腎小球系膜細胞增殖，降解細胞外基質(zhì)，防止腎小球硬化發(fā)生［21］。

本實驗通過HE 染色來觀察大鼠腎組織形態(tài)變化，Sirius red 染色來觀察腎組織膠原沉積，免疫印跡法來檢測HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達，考察補虛解毒化瘀方對單側(cè)輸尿管梗阻健側(cè)腎臟的干預(yù)作用。結(jié)果表明，給藥10 d 后模型組大鼠腎小球膠原沉積較假手術(shù)組明顯增多；與模型組比較，補虛解毒化瘀方組可減少大鼠腎小球膠原沉積，延緩其硬化進程，HIF-1α、TGF-β1蛋白表達明顯降低，提示該方延緩腎小球硬化的作用機制可能是通過改善缺氧、抑制HIF-1α 表達、下調(diào)TGFβ1蛋白表達、抑制細胞過度增殖所致。方中黃芪功效補氣行血、扶正祛邪，赤芍功效活血利水，地龍、醋鱉甲功效化瘀通絡(luò)，黃芩、金銀花功效清熱解毒，諸藥相伍，共奏益氣活血化瘀通絡(luò)、標本兼顧的作用。

綜上所述，本實驗從分子蛋白水平證實補虛解毒化瘀方是抑制單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)健側(cè)腎小球硬化的有效中藥制劑，可為相關(guān)臨床研究提供依據(jù)，也為該方有效成分的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。