張雨軒,馬雪蓮,楊漢繼,趙綺悅,高曉萌,許慶友?
(1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,河北石家莊 050091;2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室,河北石家莊 050091)
我國慢性腎臟病的發(fā)病率不斷上升[1],由梗阻性腎病導(dǎo)致的腎功能衰竭發(fā)病率也有明顯升高的趨勢。單側(cè)腎梗阻引起慢性腎衰竭的機制尚不明確,前期研究發(fā)現(xiàn),單側(cè)輸尿管梗阻可誘導(dǎo)健側(cè)腎臟細(xì)胞增殖,并隨著時間的延長發(fā)生腎臟纖維化[2]。
近幾年來,中藥復(fù)方、單味藥及提取物在治療腎小球硬化、延緩腎功能衰竭方面取得了許多新進(jìn)展[3-5],但對單側(cè)腎臟損傷誘導(dǎo)慢性腎衰竭的干預(yù)機制尚不明確。因此,本實驗觀察補虛解毒化瘀方延緩梗阻性腎病健側(cè)腎小球硬化的作用機制,以期為相關(guān)臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 動物 清潔級Sprague-Dawley 雄性大鼠40 只,4 周齡,體質(zhì)量(200±10)g,購于河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(冀)2013-1-003。隨機分為假手術(shù)組、模型組、依普利酮組、中藥組,每組10 只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實驗。
1.2 藥物 補虛解毒化瘀方組方藥材為生黃芪20 g,地龍、醋鱉甲、赤芍、黃芩、金銀花各10 g,均通過廣東一方制藥公司制成免煎顆粒。依普利酮購于美國輝瑞制藥公司。飼料經(jīng)美國Research Diets 公司加工,由東京大學(xué)Tatsuo Shimosawa 教授惠贈。
1.3 試劑 誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)抗體(批號GR194781-9)、GAPDH 抗體(批號10494-1-AP)(英國Abcam 公司);增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體(單克隆抗體,美國Proteintech 公司,批號10205-2-AP);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)抗體(批號G58021)、β-Actin 抗體(批號XS20170612031)(美國Bioworld Technology 公司);免疫組化試劑盒(北京中衫金橋有限公司,批號K186621D);脫脂奶粉(美國BD 公司,批號8064872)。
1.4 儀器 電泳儀及電泳槽(北京六一公司);Semi-Day 半干轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-Rad 公司);DP72-CCD、BX53 病理圖文拍照系統(tǒng)(日本Olympus 公司);RM 2245 石蠟切片機(德國Leica上海分公司);1-15K 高速冷凍離心機(美國Sigma公司);近紅外成像掃描儀(美國 LI-COR Biosciences 公司)。
2.1 造模 除假手術(shù)組外,其余各組大鼠結(jié)扎單側(cè)輸尿管,水合氯醛麻醉后于左側(cè)中腹部切開,游離左側(cè)輸尿管,分別在腎盂處、輸尿管上1/3 處用絲線結(jié)扎,在結(jié)扎線之間切斷輸尿管,逐層縫合腹壁皮膚[6];假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎離斷,輕輕撥動腸管后縫合皮膚。術(shù)后1 d,依普利酮組給予含藥混合飼料喂養(yǎng)(100 mg/kg)[7];中藥組參照《實驗動物學(xué)》[8]給予免煎顆粒,按1.92 g/kg(相當(dāng)于11.7 g/kg 生藥量)劑量加到3 mL蒸餾水中,每天灌胃1 次。
2.2 標(biāo)本收集 藥物干預(yù)10 d 后處死大鼠,留取健側(cè)腎臟,一部分腎組織用4%多聚甲醛固定后制備常規(guī)石蠟切片,用于免疫組織化學(xué)染色;其余組織于-70 ℃下保存,用于分子生物學(xué)檢測。
2.3 指標(biāo)檢測
2.3.1 腎組織損傷 大鼠腎組織進(jìn)行HE 染色后,在普通光鏡下觀察。為了確定腎小球的損傷程度,參照Purkerson 等[9]對腎小球病變組織學(xué)的分級標(biāo)準(zhǔn)分為(1)0 級,無任何病變;(2)Ⅰ級,系膜基質(zhì)增多,伴輕度系膜細(xì)胞增生;(3)Ⅱ級,系膜區(qū)擴大明顯,伴血管袢階段硬化和塌陷;(4)Ⅲ級,血管節(jié)段硬化,伴血管袢明顯塌陷;(5)Ⅳ級,腎小球硬化,伴透明病變,每張切片觀察20 個腎小球,歸于上述5 個等級,計算各等級腎小球所占比例,計算病理積分,進(jìn)行半定量分析。
2.3.2 膠原纖維 大鼠腎組織進(jìn)行Sirius red 染色后,在普通光鏡下觀察,以紅色膠原沉積為陽性信號。通過Image Proplus 多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行分析,計算腎小球膠原沉積面積與腎小球總面積的比值,取平均值。
2.3.3 HIF-1α、PCNA 相對表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法。HIF-1α 免疫染色評分為陽性細(xì)胞范圍與染色強度之和,陽性細(xì)胞范圍≤25% 為0 分,26%~50%為1 分,51%~75%為2 分,76%~100%為3 分;染色強度0 分為陰性著色,1 分為淡黃色,2 分為淺褐色,3 分為深褐色,每張切片觀察20 個腎小球并分別計分,PCNA 檢測腎小球陽性細(xì)胞占腎小球細(xì)胞總數(shù)的比例,進(jìn)行半定量分析。
2.3.4 HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達(dá) 采用免疫蛋白印跡法。提取大鼠腎皮質(zhì)蛋白,BCA 測定濃度后在95 ℃下變性,取30~60 μg 進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,BSA 封閉1 h,加入一抗(1∶200~1∶1 000),4 ℃下孵育過夜,TBST 清洗3 次,每次8 min,加入二抗,室溫下孵育1 h,TBST 清洗3 次,每次8 min,TBS 清洗5 min,紅外激光成像系統(tǒng)掃描,所得結(jié)果以內(nèi)參校正。
2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,計量資料以()表示,多組間比較先采用方差分析,再采用Tukey 檢驗(均為雙側(cè)檢驗)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.1 大鼠腎組織病理變化 HE 染色顯示,假手術(shù)組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)無異常,血管袢開放良好;模型組大鼠腎小球體積增大,系膜細(xì)胞增殖明顯(P<0.05);依普利酮、中藥組大鼠細(xì)胞增殖較模型組減輕(P<0.05)。Sirius red 染色顯示,模型組膠原沉積多于假手術(shù)組(P<0.05),依普利酮、中藥組膠原沉積更少(P<0.05)。見圖1、表1。
圖1 各組大鼠健側(cè)腎臟病理變化及HIF-1α、PCNA 相對表達(dá)(×400)Fig.1 Renal pathological changes and HIF-1α,PCNA relative expressions in contralateral kidneys of rats in various groups(×400)
表1 各組大鼠健側(cè)腎臟膠原沉積(, n=6)Tab.1 Collagen deposition of contralateral kidneys of rats in various groups(, n=6)
表1 各組大鼠健側(cè)腎臟膠原沉積(, n=6)Tab.1 Collagen deposition of contralateral kidneys of rats in various groups(, n=6)
注:與假手術(shù)組比較,?P<0. 05;與模型組比較,#P<0.05。
3.2 大鼠腎組織HIF-1α、PCNA 相對表達(dá) 假手術(shù)組大鼠HIF-1α 僅在腎小管呈弱表達(dá),主要見于細(xì)胞漿內(nèi);模型組大鼠HIF-1α 相對表達(dá)增強(P<0.05),可見于腎小管及腎小球,小球內(nèi)大量細(xì)胞核著色,呈棕色黃染顆粒;中藥組、依普利酮組大鼠腎小管內(nèi)少量著色,主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi),HIF-1α 相對表達(dá)低于模型組(P<0.05)。見圖1、表2。
假手術(shù)組大鼠PCNA 陽性細(xì)胞較少,可見于腎小管及腎小球;模型組大鼠腎小球陽性細(xì)胞增多(P<0.05);中藥組、依普利酮組大鼠PCNA 陽性細(xì)胞少于模型組(P<0.05)。見圖1、表3。
表2 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α 相對表達(dá)(, n=6)Tab.2 Relative expressions of HIF-1α in contralateral kidneys of rats in various groups(, n=6)
表2 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α 相對表達(dá)(, n=6)Tab.2 Relative expressions of HIF-1α in contralateral kidneys of rats in various groups(, n=6)
注:與假手術(shù)組比較,?P<0. 05;與模型組比較,#P<0.05。
表3 各組大鼠健側(cè)腎臟PCNA 相對表達(dá)(, n=6)Tab.3 Relative expressions of PCNA in contralateral kidneys of rats in various groups(, n=6)
表3 各組大鼠健側(cè)腎臟PCNA 相對表達(dá)(, n=6)Tab.3 Relative expressions of PCNA in contralateral kidneys of rats in various groups(, n=6)
注:與假手術(shù)組比較,?P<0. 05;與模型組比較,#P<0.05。
3.3 大鼠腎組織HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達(dá) 模型組HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05),中藥組、依普利酮組三者蛋白表達(dá)低于模型組(P<0.05)。見圖2、表4。
圖2 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of HIF-1α,TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats
表4 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達(dá)(, n=3)Tab.4 Protein expressions of HIF-1α,TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats(, n=3)
表4 各組大鼠健側(cè)腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達(dá)(, n=3)Tab.4 Protein expressions of HIF-1α,TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats(, n=3)
注:與假手術(shù)組比較,?P<0. 05;與模型組比較,#P<0.05。
大多數(shù)梗阻性腎病如能及時發(fā)現(xiàn)并解除梗阻、引流腎臟尿液,則可部分或完全恢復(fù),但部分患者腎功能仍然無法恢復(fù),甚至繼續(xù)惡化,進(jìn)展為慢性腎衰竭,故健側(cè)腎臟受損可能是發(fā)生該疾病的重要原因。受損的腎臟可以表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化,梗阻性腎病以間質(zhì)纖維化關(guān)注主多,而對腎小球尤其是健側(cè)(對側(cè))腎臟關(guān)注不夠,腎間質(zhì)纖維化的改變與小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、浸潤而來的多種炎性細(xì)胞相關(guān),腎小球硬化的主要病理特征為系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚[10]。
大量研究表明,腎小球系膜細(xì)胞是導(dǎo)致Ⅰ型膠原等系膜基質(zhì)成分不斷增加的主要效應(yīng)細(xì)胞,腎小球固有細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常積聚是導(dǎo)致腎小球硬化的重要因素,故有效地抑制腎小球細(xì)胞增殖對延緩腎小球硬化有重要意義。細(xì)胞增殖與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)密切相關(guān),后者是一種僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細(xì)胞核內(nèi)的酸性蛋白質(zhì),故其表達(dá)增強表明細(xì)胞正處于增生狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)與腎小球硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),它是一個多功能細(xì)胞因子,可促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)ECM 積聚[10],被公認(rèn)為是腎小球硬化的治療靶標(biāo)[11]。在過去,腎臟缺氧被認(rèn)為是纖維化過程的結(jié)果而不是誘因,但最近研究表明缺氧可能是腎臟疾病進(jìn)展的早期潛在的起始事件[12-14],炎癥反應(yīng)、活性氧(ROS)均可調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá),細(xì)胞在增殖過程中消耗大量氧氣也可激活[15],它是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,由ɑ、β 亞基組成,可刺激缺氧基因產(chǎn)物的表達(dá),促進(jìn)腎纖維化和慢性腎病進(jìn)展[16],慢性缺氧可通過抑制其降解來增加蛋白累積,從而使其高表達(dá),并可上調(diào)TGF-β1來促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此,慢性缺氧可能是引起腎小球硬化的重要原因。
慢性腎臟病根據(jù)其臨床表現(xiàn)和發(fā)病特點,歸屬于中醫(yī)的“水腫”“關(guān)格”“癃閉”等范疇。目前普遍認(rèn)為,腎小球硬化是虛實夾雜、本虛標(biāo)實之證,本虛表現(xiàn)為脾腎虧虛,標(biāo)實表現(xiàn)為瘀血、水腫、濁毒等,正氣虧虛是腎小球硬化的根本原因,瘀血是加重腎小球硬化的重要因素。遵循中醫(yī)“既病防變”理論,在慢性腎臟病的治療過程中不僅要關(guān)注已經(jīng)發(fā)生的疾病,對于尚未發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生但未深入的病變更要重視。對于梗阻性腎病而言,不僅要研究梗阻側(cè)腎臟病變,還要考察對側(cè)腎臟的病理生理變化。
現(xiàn)代研究表明,中藥對防治腎小球硬化有獨特療效。例如,黃芪含藥血清可抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖[17],其總皂苷能抑制高糖誘導(dǎo)下系膜細(xì)胞的過度增殖[18];芪歸益腎方可通過調(diào)節(jié)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白來有效延緩單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟纖維化[19];丹參注射液可下調(diào)TGF-β1表達(dá),提高活性氧水平,延緩腎小球硬化[20];地龍能通過抗氧化等途徑抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖,降解細(xì)胞外基質(zhì),防止腎小球硬化發(fā)生[21]。
本實驗通過HE 染色來觀察大鼠腎組織形態(tài)變化,Sirius red 染色來觀察腎組織膠原沉積,免疫印跡法來檢測HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達(dá),考察補虛解毒化瘀方對單側(cè)輸尿管梗阻健側(cè)腎臟的干預(yù)作用。結(jié)果表明,給藥10 d 后模型組大鼠腎小球膠原沉積較假手術(shù)組明顯增多;與模型組比較,補虛解毒化瘀方組可減少大鼠腎小球膠原沉積,延緩其硬化進(jìn)程,HIF-1α、TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低,提示該方延緩腎小球硬化的作用機制可能是通過改善缺氧、抑制HIF-1α 表達(dá)、下調(diào)TGFβ1蛋白表達(dá)、抑制細(xì)胞過度增殖所致。方中黃芪功效補氣行血、扶正祛邪,赤芍功效活血利水,地龍、醋鱉甲功效化瘀通絡(luò),黃芩、金銀花功效清熱解毒,諸藥相伍,共奏益氣活血化瘀通絡(luò)、標(biāo)本兼顧的作用。
綜上所述,本實驗從分子蛋白水平證實補虛解毒化瘀方是抑制單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)健側(cè)腎小球硬化的有效中藥制劑,可為相關(guān)臨床研究提供依據(jù),也為該方有效成分的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。