馮曉異,何朋倫,趙 微,姚 政,陳文慧
(云南中醫(yī)藥大學,云南昆明 650500)
非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史,以肝細胞內(nèi)甘油三酯蓄積過多、彌漫性肝細胞脂肪變性為主要病理特征的臨床綜合征[1],屬于代謝應激性肝損傷疾病,發(fā)病與胰島素抵抗、遺傳易感性密切相關(guān),炎癥因子失衡是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。NF-κB 信號通路是炎癥信號轉(zhuǎn)導途徑中的主要通路之一,可上調(diào)編碼炎癥介質(zhì)和細胞因子的促炎基因表達,從而進一步激活誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等相關(guān)酶類及血管細胞黏附分子,炎癥反應得以級聯(lián)放大[3-5],同時iNOS 的激活進一步釋放大量NO,后者是細胞間信息交換的重要載體之一,廣泛參與生理功能的調(diào)節(jié)和病理過程的發(fā)生[6-7]。
三七為五加科植物,以干燥根、根莖入藥,其味甘、微苦,屬云南道地藥材,也是活血祛瘀、通脈活絡的常用臨床用藥,在治療血證,尤其是瘀血方面有“金不換”之稱,其主要成分三七總皂苷是關(guān)鍵藥效物質(zhì)[8-10],具有影響炎性免疫反應的作用[11-13]。本實驗在前期研究[14]基礎(chǔ)上,進一步探討在非酒精性脂肪肝病理進展中三七總皂苷對血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂生化指標、肝組織中NO 和iNOS 表達的影響,以及對iNOS/NO/NF-κB 通路的調(diào)節(jié)作用,并分析各項檢測指標與非酒精性脂肪肝進展及該成分作用之間的關(guān)系,以期為深入研究相關(guān)可能機制奠定理論基礎(chǔ)。
1.1 動物 96 只SPF 級SD 雄性大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,由四川省成都達碩生物有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2014-23,飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學SPF 實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境符合清潔級動物環(huán)境標準,室內(nèi)安靜,自然采光,通風良好,溫度濕度保持恒定。
1.2 試劑與藥物 三七總皂苷(批號TB20171210,西安天寶生物科技有限公司,純度>95%)。0.9%氯化鈉溶液(批號SO97A62,中國大家制藥有限公司);高密度脂蛋白檢測試劑盒(A112-1,批號20160301)、低密度脂蛋白檢測試劑盒(A113-1,批號20160219)、甘油三酯檢測試劑盒(A110-1,批號20160525)、總膽固醇檢測試劑盒(A111-1,批號20160522)、ALT 檢測試劑盒(A009-2,批號 20160622)、AST 檢測試劑盒(A010-2,批號20160625)(南京建成生物科技有限公司);總NO 檢測試劑盒(KGE001,批號335566,美國R&D 公司);一氧化氮合成酶檢測試劑盒(KA1634,批號62316,美國Abnova 公司);iNOS、NF-κB、p-NF-κB、IKKα、p-IKKα、p-IkBα 抗體(美國Cell Signaling Technology 公司)。
2.1 模型建立 采用88%普通飼料加10%豬油、2%膽固醇的高脂飼料喂養(yǎng)SD 大鼠,建立高脂性早期脂肪肝模型,并按非酒精性脂肪肝病診療指南(2010 年修訂版)病理學診斷標準進行評價。
2.2 分組與給藥 96 只大鼠按隨機數(shù)字表法分為6 組,每組16 只,分別為空白組(普通飼料飼養(yǎng),生理鹽水灌胃給藥)、模型組(高脂飼料飼養(yǎng),生理鹽水灌胃給藥)、三七總皂苷低劑量組(高脂飼料飼養(yǎng),4.5 mg/kg 三七總皂苷灌胃給藥)、三七總皂苷中劑量組(高脂飼料飼養(yǎng),9 mg/kg 三七總皂苷灌胃給藥)、三七總皂苷高劑量組(高脂飼料飼養(yǎng),18 mg/kg 三七總皂苷灌胃給藥)、⑥辛伐他汀組(高脂飼料飼養(yǎng),2 mg/kg 辛伐他汀灌胃給藥),各組給藥容量均為10 mL/kg,每天1 次,連續(xù)12 周。于給藥第8、12 周末取材(每組8 只),進行相關(guān)指標檢測,藥物水平依據(jù)動物實驗用藥公式計算,即大鼠給藥量=(6.3×每天成人給藥量)×大鼠體質(zhì)量(平均200 g)/成人體質(zhì)量(60 kg)。
2.3 大鼠肝組織病理形態(tài)觀察 取材前大鼠禁食不禁水12 h,取材當日迅速打開麻醉后大鼠的胸腔,取出肝組織,于最大葉上取約1 cm3大小置于4%多聚甲醛中保存,制作石蠟切片用于HE 染色,其余肝組織于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
2.4 大鼠血清生化指標檢測 各組大鼠麻醉后腹主動脈采血,4 ℃下3 000 r/min 離心15 min 后,取上清液,根據(jù)羅氏生化分析儀操作步驟檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平。肝組織勻漿后,5 500 r/min 離心15 min,取上清液檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。
2.5 大鼠肝組織NO、iNOS 表達檢測 采用ELISA 法。將肝臟置于5 倍量組織勻漿緩沖液(10 倍體積RIPA 裂解液+1/100 體積蛋白酶抑制劑)中,4 ℃下勻漿,勻漿液5 500 r/min 離心15 min,取上清液,按ELISA 試劑盒說明書要求進行檢測。
2.6 大鼠肝組織iNOS 相關(guān)表達檢測 采用免疫組化法。按“2.3”項下方法制備石蠟切片后進行烤片、水化、抗原修復,再滴加iNOS 抗體,DAB 顯色,光學顯微鏡拍照,通過Image J 軟件對圖片進行iNOS 表達陽性細胞占比計算。
2.7 大鼠肝組織NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達檢測 取大鼠肝臟組織約20 mg,按1∶10 比例加入RIPA 強效裂解液,按1∶100 比例加入蛋白酶抑制劑,4 ℃下組織勻漿,勻漿液12 000 r/min 離心10 min,取上清液,BCA 法進行蛋白定量,蛋白變性后取30 μg 進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜至NC 膜,4 ℃下孵育一抗過夜,PBST 洗膜后室溫下孵育二抗1 h,PBST 洗膜,ECL 顯色后在TANON 凝膠成像儀上曝光檢測條帶,通過Image J 軟件進行條帶灰度分析。
2.8 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理,計量資料符合正態(tài)性以()表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK 法;不符合正態(tài)性,則進行非參數(shù)檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。
3.1 三七總皂苷對大鼠肝組織細胞形態(tài)的影響
3.1.1 模型組 給藥8 周末,大鼠肝組織每單位面積視野下超過1/3 的肝細胞出現(xiàn)脂肪變性,多數(shù)肝細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴,但尚未融合成大的脂肪空泡,炎癥程度較輕。給藥12 周末,模型組大鼠肝細胞出現(xiàn)大量脂肪空泡,將細胞核擠向胞膜一側(cè),大量肝細胞出現(xiàn)明顯氣球樣變,多數(shù)視野下肝索結(jié)構(gòu)難以辨認,并伴隨明顯的炎細胞浸潤和肝細胞壞死情況。見圖1。
3.1.2 給藥組 給藥8 周末,辛伐他汀組大鼠未觀察到脂肪變性,肝索排列規(guī)則,肝小葉結(jié)構(gòu)正常;三七總皂苷高劑量組大鼠偶見個別肝細胞存在脂肪空泡,肝細胞結(jié)構(gòu)、肝索排列、肝小葉結(jié)構(gòu)無明顯異常;三七總皂苷中、低劑量組大鼠有散在的肝細胞中出現(xiàn)脂滴的聚集,中劑量組出現(xiàn)脂滴的程度明顯少于低劑量組。給藥12 周末,辛伐他汀組、正常組大鼠無明顯差異,三七總皂苷高劑量組大鼠雖然大部分細胞出現(xiàn)明顯的細胞水腫,但脂變、炎癥程度都低于中、低劑量組,三七總皂苷低劑量組脂變程度和炎癥程度最高。見圖1。
圖1 第8、12 周各組大鼠肝組織病理形態(tài)(HE,10×40)Fig.1 Pathological morphologies of rat liver tissues in various groups in the 8th and 12th weeks(HE,10×40)
3.2 三七總皂苷對大鼠血清ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平的影響 給藥8 周末,與模型組比較,各給藥組大鼠血清ALT、TC、TG、LDL 水平降低(P<0.05),除三七總皂苷高劑量組外各給藥組AST 水平降低(P<0.05),除辛伐他汀組外各給藥組HDL 水平降低(P<0.05)。給藥12 周末,與空白組比較,模型組ALT、AST、LDL 水平升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組ALT、AST、TC、TG、LDL 水平降低(P<0.05),除三七總皂苷低劑量組外各給藥組HDL 水平無明顯變化(P>0.05);除空白組外,各組HDL 水平呈下降趨勢,以模型組、辛伐他汀組更明顯(P<0.05);各組LDL 水平呈上升趨勢,以模型組更明顯(P<0.01);與同一時間點模型組比較,各給藥組LDL水平降低(P<0.05)。見圖2。
圖2 第8、12 周各組大鼠血清生化指標Fig.2 Rat serum biochemical indices in various groups in the 8th and 12th weeks
3.3 三七總皂苷對大鼠肝組織NO、iNOS 表達的影響
3.3.1 NO 表達 給藥8 周末,與模型組比較,辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組NO 表達降低(P<0.01)。給藥12 周末,與模型組比較,辛伐他汀組及三七總皂苷中、高劑量組NO 水平降低(P<0.05)。見圖3。
圖3 第8、12 周大鼠肝組織NO 表達Fig.3 NO expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks
3.3.2 三七總皂苷對大鼠肝組織iNOS 表達的影響 給藥8 周末,與模型組比較,辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組iNOS 表達降低(P<0.05),以三七總皂苷高劑量組更明顯(P<0.01)。給藥12 周末,與模型組比較,辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組iNOS 表達降低(P<0.01)。見圖4。
圖4 第8、12 周大鼠肝組織iNOS 表達Fig.4 iNOS expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks
3.3.3 三七總皂苷對大鼠肝組織iNOS 相對表達的影響 模型組大鼠iNOS 陽性細胞數(shù)量從第8 周的(4.89±1.04)% 升高到12 周的(5.57±0.44)%,辛伐他汀組從(0.75±0.03)% 升高到(2.89±1.60)%,三七總皂苷低、中、高劑量組分別從(1.20±0.26)%、(1.69±0.22)%、(2.21±0.28)%升高到(1.40±0.08)%、(1.73±0.51)%、(3.17±0.96)%;與模型組比較,各給藥組iNOS 表達降低(P<0.01)。見圖5。
3.4 三七總皂苷對大鼠肝組織NF-κB、p-NF-κB、IKKα、p-IKKα、IkBα 蛋白表達的影響 給藥12 周末,與模型組比較,辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組NF-κB 蛋白表達及磷酸化水平降低(P<0.05);辛伐他汀組IKKα 蛋白表達及磷酸化水平降低(P<0.05);三七總皂苷中、高劑量組IKKα磷酸化水平降低(P<0.05);除三七總皂苷低劑量組外,各給藥組IκBα 蛋白表達降低(P<0.05)。見圖6。
圖5 第8 周、12 周大鼠肝組織iNOS 相對表達Fig.5 iNOS relative expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks
圖6 第12 周大鼠肝組織NF-κB、IKKα、IκBα 蛋白表達Fig.6 Protein expressions of NF-κB,IKKα and IκBα in rat liver tissues in the 12th weeks
非酒精性脂肪肝是一種代謝應激性肝損傷疾病,包括非酒精性單純性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝細胞癌[15]。中醫(yī)認為,肝郁脾虛是非酒精性脂肪肝發(fā)生基礎(chǔ),痰濁瘀毒則為其主要病理因素,痰濕淤血濕交阻互結(jié),肝臟脈絡阻遏,從而形成該疾病,祛痰化瘀是治療首要目標。三七在治療血證,尤其是淤血方面的獨特作用,讓該藥材在臨床時被廣泛使用,對其作用機理的深入闡釋將為相關(guān)藥物的合理使用奠定理論基礎(chǔ)。
機體受到來自內(nèi)部或外部的刺激時,會產(chǎn)生炎癥反應,其適度時在一定程度上可起到保護機體的作用,但長期、劇烈的炎癥會參與多種疾病的病理進程[16],誘導產(chǎn)生大量iNOS,可很快從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)免疫細胞或其他內(nèi)源免疫反應組織的活性,進一步釋放NO[17],后者與O2-結(jié)合后生成一種更強的氧化劑ONOO-,導致自由基反應加劇、細胞損傷。在病理條件下,iNOS 強表達是臟器損傷和加重的重要原因,同時NO 可彌散入細胞抑制三羧酸循環(huán),抑制線粒體呼吸鏈上某些限速酶,干擾能量代謝,減少ATP 合成,加劇組織損傷。炎癥過程中NF-κB 處于活化狀態(tài),從而促使炎癥基因表達上調(diào),激活iNOS 等相關(guān)酶類及血管細胞黏附分子,使炎癥反應級聯(lián)放大,其活化二聚體可易位進入細胞核內(nèi)與靶基因發(fā)生特異性結(jié)合,從而調(diào)控NO 的生成、細胞因子表達和釋放[18-19]。
本實驗發(fā)現(xiàn),高脂飼料飼養(yǎng)8 周末模型組大鼠肝臟已產(chǎn)生脂肪代謝障礙,而各給藥組未觀察到脂肪變性及結(jié)構(gòu)異常,其中三七總皂苷僅中、低劑量新出現(xiàn)脂滴聚集,并體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系;12 周末,模型組大鼠肝細胞呈現(xiàn)明顯的炎細胞浸潤和肝細胞壞死情況,而各給藥組能顯著改善肝細胞的形態(tài),抑制炎性發(fā)生,阻止細胞壞死;辛伐他汀、三七總皂苷各劑量組大鼠血清AST、ALT、LDL-C、TC、TG 水平顯著下調(diào)(P<0.05),其中大部分指標體現(xiàn)了量效關(guān)系;三七總皂苷各劑量組對肝組織NO、iNOS 水平及NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達有調(diào)節(jié)作用,印證了該成分對非酒精性脂肪肝大鼠炎癥相關(guān)因子的抑制作用,從而可發(fā)揮緩解炎癥反應、保護肝臟的活性。
綜上所述,在非酒精性脂肪肝的形成及其進展過程中,三七總皂苷可有效降酶降脂,減輕炎癥,改善肝臟功能和炎癥反應,其機制可能與下調(diào)NO/iNOS/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)。