張 義，于鵬洋，鄭思琦，孫麗英，葛鵬玲

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000）

2 型糖尿病是由高血糖引起的一種全球流行病，可影響到不同性別、年齡、種族人群，有明顯的遺傳基礎(chǔ)［1］，胰島素抵抗是導(dǎo)致其發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制之一，表現(xiàn)為胰島素生物效應(yīng)的敏感性降低或喪失，它發(fā)生在病情前期，并貫穿于疾病發(fā)展全過程［2-3］。當(dāng)胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，肝臟對葡萄糖的攝取和利用率降低，胰島素刺激肝臟攝取利用葡萄糖是通過磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT4）等一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程完成的［4-5］，其主要發(fā)生機(jī)制與胰島素信號傳遞受阻或減弱有關(guān)，其中PI3K 途徑是胰島素信號傳導(dǎo)的主要通路［6］。

課題組前期研究表明［7］，鈣敏感受體（CaSR）拮抗劑可抑制AKT 活性，CaSR 激動(dòng)劑能增強(qiáng)AKT活性，并在大鼠肝臟中存在CaSR 表達(dá)。通過脂肪乳灌胃加小劑量注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠發(fā)生的胰島素抵抗模型，可導(dǎo)致CaSR 明顯下調(diào)，同時(shí)可抑制與胰島素抵抗關(guān)系密切的PI3K／AKT 信號通路中的AKT 蛋白（Ser473、Thr308 位點(diǎn)）磷酸化蛋白表達(dá)，從而誘發(fā)并加重胰島素抵抗癥狀［8-9］。

花旗澤仁由西洋參、薏苡仁、澤瀉組成，是臨床治療2 型糖尿病胰島素抵抗的經(jīng)驗(yàn)方。課題組前期研究表明，大鼠胰島素抵抗模型給予該方后，可明顯降低空腹血糖、空腹胰島素水平，提高胰島素敏感指數(shù)，上調(diào)CaSR mRNA、蛋白表達(dá)及磷酸化AKT 活性，可能是通過調(diào)節(jié)CaSR、激活PI3K／AKT 信號通路上Thr308 和Ser473 磷酸化位點(diǎn)、影響PI3K 通路來改善胰島素抵抗。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光法、qRT-PCR、Western blot 檢測胰島素抵抗誘導(dǎo)L02 肝細(xì)胞中CaSR 分布、mRNA、蛋白及磷酸化AKT（Ser473 和Thr308）蛋白表達(dá)，從而進(jìn)一步在細(xì)胞水平探究花旗澤仁對2 型糖尿病胰島素抵抗的治療作用及其機(jī)制，為其臨床應(yīng)用及推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人正常肝細(xì)胞株L02，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試劑與藥物 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；葡萄糖檢測試劑盒（美國Sigma 公司）；羅格列酮（英國葛蘭素史克公司）；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（北京鼎國生物科技有限公司）；胰島素注射液（徐州萬邦生化制藥有限公司）；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix（韓國Bioneer 公司）；Trizol Reagen（英國Invitrogen 公司）；CaSR抗體和β-actin（英國Abcam 公司）；AKT 抗體、pAKT（S473）抗體、pAKT（T308）抗體（美國Cell signaling 公司）。

1.3 儀器 微量臺式低溫離心機(jī)Mircro 17R、細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺（美國Thermo Fisher 公司）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Vortex-Genie 2 渦旋混合儀（美國Scientific Industries 公司）；液閃儀（美國SIM-MAX 公司）；HEV-50 高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；Universal HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀、梯度單頭PCR 儀、S1000 和CFX96 Real-time PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 動(dòng)物 清潔級SD 大鼠20 只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK2018-003，操作過程符合學(xué)術(shù)倫理要求。實(shí)驗(yàn)開始前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由攝食和飲水，房間溫度在20 ℃左右，濕度50%左右。

1.5 花旗澤仁水煎液制備 花旗澤仁組方藥材西洋參、澤瀉、薏苡仁購于黑龍江省世一堂中藥飲片廠，熬制前將3 味中藥分別浸泡12 h 后加入適量水煎煮3 次，第1 次水沸后小火煎煮60 min，第2 次水沸后繼續(xù)用小火煎煮45 min，第3 次水沸后小火煎煮30 min，合并水煎液，濾過，水浴濃縮，即得，生藥量約為0.54 g／mL，4 ℃下保存。

1.6 10%花旗澤仁含藥血清制備 取正常SD 大鼠20 只，隨機(jī)分為空白組、給藥組，每組10 只，雌雄各半，給藥組大鼠按10 mL／kg 容量灌胃給予花旗澤仁水煎液，空白組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每天2 次，連續(xù)7 d。課題組前期對花旗澤仁主要活性成分在大鼠血漿中藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在末次給藥后1 h 其血藥濃度達(dá)到峰值，故在該時(shí)間點(diǎn)按3.5 mL／kg 容量腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈采血，室溫下血液靜置30 min，4 ℃下3 000 r／min 離心15 min，靜置15 min 后取上清液，同組混勻，56 ℃下滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得含藥血清，除菌分裝后-80 ℃下保存?zhèn)溆谩ＥR用前，將其用RPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋成10%。

1.7 陽性對照藥制備 取羅格列酮4.735 mg，溶于l mL DMSO 中，制成10 mmol／L 母液，即得，冷凍保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)最終濃度為10 μmol／L。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人正常肝L02 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1% 雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱條件中，每天換液，待細(xì)胞生長至約90% 時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，取對數(shù)生長期者用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 模型建立 將消化好的L02 細(xì)胞懸液用PBS緩沖液洗滌2 次，按3×105細(xì)胞／孔的濃度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為空白對照組、模型對照組，加入含10% 胎牛血清、5.6 mmol／L 葡萄糖的無酚紅RPMI1640 培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)36 h，形成單層貼壁細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌2 次，再用無血清、無酚紅的培養(yǎng)液（含1%FBS）培養(yǎng)24 h。模型對照組每孔加入2 mL新配制的含5×10-7mol／L 人胰島素的無血清、無酚紅培養(yǎng)液，空白對照組加入不含胰島素的無血清、無酚紅培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

2.3 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞用PBS 緩沖液洗滌2 次，加入含100 ng／mL 人胰島素的培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)30 min 后加入葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)液上清，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶（GOD-POD）法在510 nm 波長處檢測光密度（OD）值，計(jì)算葡萄糖含量，公式為含量＝待測液OD值／標(biāo)準(zhǔn)液OD值×5.5 mmol／L。

2.4 CaSR 表達(dá)的細(xì)胞定位檢測 采用免疫熒光法。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分為常規(guī)培養(yǎng)的空白對照組、胰島素抵抗L02 模型對照組（同“2.2”項(xiàng)）、建模后的L02 胰島素抵抗細(xì)胞加入10%花旗澤仁含藥血清RPMI-1640 培養(yǎng)基的花旗澤仁組，將各組細(xì)胞爬片用PBS 緩沖液浸洗后用4%多聚甲醛（100 μmol／L）固定，滴加正常山羊血清10%封閉液室溫封閉30 min，將爬片轉(zhuǎn)移至載玻片，吸掉封閉液，每張爬片滴加足夠量稀釋好的一抗（1∶500），4 ℃下孵育過夜。次日開始避光，將爬片轉(zhuǎn)移至孔板中，加入PBST（PBS∶T80 ＝500 mL∶500 μL）緩沖液，置于搖床上浸洗，吸水紙吸干后移到載玻片上，滴加稀釋好的熒光二抗（1∶200 PBST）孵育1 h，移至孔板中，PBST 緩沖液浸洗爬片，將爬片移出孔板，置于載玻片上，加入DAPI 熒光染料避光孵育后對標(biāo)本進(jìn)行染核，置于孔板中，PBST 緩沖液洗去多余DAPI，移至載玻片上，滴加抗熒光催滅劑進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2.5CaSRmRNA 表達(dá)檢測 采用qRT-PCR 法。向胰島素抵抗L02 細(xì)胞模型中加入含1.0 ×10-5mol／L羅格列酮的RPMI-1640 培養(yǎng)基，作為陽性對照組，其他分組同“2.4”項(xiàng)，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。造模給藥24 h 后收集細(xì)胞，應(yīng)用Trizol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，并檢測總RNA 完整性，計(jì)算其濃度和純度。反應(yīng)體系為12.5 μL 2 ×Greenstar Master Mix +2.0 μL cDNA 樣本+1.0 μL 引物 F-primer（TTCTTTGAACCTGGACGACGAGT）+8.5 μL 引物R-primer（GCGAGGAAGGATTTGTAC）1.0 μL +DEPC（焦碳酸二乙酯），反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s；47 ℃退火30 s；47 ℃延伸30 s；40 個(gè)循環(huán)。

2.6 CaSR 蛋白表達(dá)量及Akt 活性檢測 采用Western blot 法。細(xì)胞分組、給藥、處理同“2.5”項(xiàng)，藥物作用24 h 后掛法收集細(xì)胞，冰上裂解30 min后4 ℃下12 000 r／min 離心10 min，吸取上清，加入蛋白上樣裂解液，100 ℃下煮沸，分裝，-80 ℃下保存?zhèn)溆?。Bradford 法測定蛋白濃度，取等量蛋白，SDS-PAGE（5% 濃縮膠-12% 分離膠）分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，室溫下封閉2 h，4 ℃一抗（稀釋比例1∶1 000）孵育過夜，室溫二抗（稀釋比例1∶5 000）孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色曝光。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，2 組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 高胰島素誘導(dǎo)對L02 肝細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 與空白對照組比較，模型對照組葡萄糖消耗量降低（P＜0.01），葡萄糖剩余量升高（P＜0.01），提示細(xì)胞已處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，即IR L02 肝細(xì)胞模型建立成功。見表1。

表1 高胰島素誘導(dǎo)對L02 肝細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（， n＝6）Tab.1 Effect of high-insulin induction on glucose consumption in L02 liver cells（， n＝6）

表1 高胰島素誘導(dǎo)對L02 肝細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（， n＝6）Tab.1 Effect of high-insulin induction on glucose consumption in L02 liver cells（， n＝6）

注：與空白對照組比較，??P＜0.01。

3.2 花旗澤仁對胰島素抵抗L02 肝細(xì)胞中CaSR分布的影響 與空白對照組比較，模型對照組CaSR 分布較稀疏；與模型對照組比較，花旗澤仁組CaSR 分布較密集。見圖1～3。

圖1 空白對照組L02 肝細(xì)胞中CaSR 分布（×100）Fig.1 Distribution of CaSR in L02 liver cells of blank control group（×100）

圖2 模型對照組L02 肝細(xì)胞中CaSR 分布（×100）Fig.2 Distribution of CaSR in L02 liver cells of model control group（×100）

3.3 花旗澤仁對胰島素抵抗L02 肝細(xì)胞中CaSRmRNA 表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型對照組CaSRmRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組CaSRmRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。見圖4。

圖3 花旗澤仁組L02 肝細(xì)胞中CaSR 分布（×100）Fig.3 Distribution of CaSR in L02 liver cells of Huaqizeren group（×100）

圖4 花旗澤仁對L02 肝細(xì)胞中CaSR mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Huaqizeren on CaSR mRNA expression in L02 liver cells

3.4 花旗澤仁對胰島素抵抗L02 肝細(xì)胞中CaSR蛋白表達(dá)的影響 藥物作用24 h 后，與空白對照組比較，模型對照組CaSR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組CaSR 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。見圖5。

3.5 花旗澤仁對胰島素抵抗L02 肝細(xì)胞中磷酸化AKT 蛋白表達(dá)的影響 藥物作用24 h 后，與空白對照組比較，模型對照組磷酸化AKT（Thr308、Ser473）蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組磷酸化AKT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖6。

4 討論

在過去幾十年，2 型糖尿病的患病率顯著上升，目前雖然不能根治，但可以較好地控制。胰島素抵抗是2 型糖尿病重要病理特征，是指組織或機(jī)體靶器官對胰島素生物效應(yīng)的敏感性降低或喪失［10-12］，西醫(yī)治療存在不可避免的嚴(yán)重問題，而中醫(yī)重視辨證論治、整體調(diào)節(jié)，在治療上有突出的優(yōu)勢。肝臟能攝取血液中的糖類，合成肝糖原，并降低血糖，通過分解肝糖原、肝臟糖異生途徑來升高血糖［13］，它作為人體重要的代謝器官，其糖代謝水平直接關(guān)系到血糖穩(wěn)定［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)選取L02 肝細(xì)胞，在細(xì)胞水平上探討治療2 型糖尿病胰島素抵抗的分子機(jī)制。

圖5 花旗澤仁對L02 肝細(xì)胞中CaSR 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Huaqizeren on CaSR protein expression in L02 liver cells

圖6 花旗澤仁對L02 肝細(xì)胞中磷酸化AKT 蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Huaqizeren on phosphorylated AKT protein expression in L02 liver cells

Leech 等［15］發(fā)現(xiàn)，鈣敏感受體（CaSR）可能具有調(diào)節(jié)糖誘導(dǎo)的胰島素分泌功能；Li 等［16］報(bào)道，CaSR 活性與蛋白激酶B（AKT）活性呈正相關(guān)，提示其作用與PI3K／AKT 信號通路有關(guān)。PI3K 信號通路的激活可提高細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力，改善胰島素抵抗，其機(jī)制在于激活綁定在磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸上的絲氨酸或蘇氨酸（Thr308，Ser473）2 個(gè)主要磷酸化位點(diǎn)，從而激活A(yù)KT 傳導(dǎo)生物信號。

前期研究表明，胰島素抵抗大鼠肝組織中CaSR 基因、蛋白表達(dá)、AKT 活性均下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中采用免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證了L02 肝細(xì)胞中存在CaSR 受體分布，而且模型對照組中低于空白對照組中；采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)（qRT-PCR）發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗L02 肝細(xì)胞模型對照組中CaSRmRNA 表達(dá)較空白對照組中有明顯下降趨勢；采用免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）觀察到，胰島素抵抗L02 肝細(xì)胞模型對照組中CaSR 蛋白、AKT 磷酸化（Thr308，Ser473）蛋白表達(dá)較空白對照組中也呈下降趨勢。

另外，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在L02 肝細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)了胰島素抵抗會影響CaSR 的功能性表達(dá)，降低其分布，下調(diào)CaSR 基因及蛋白表達(dá)，同時(shí)會抑制PI3K／AKT 信號通路上2 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Thr308，Ser473）活性；花旗澤仁干預(yù)后，可明顯下調(diào)模型對照組大鼠血糖值，升高胰島素敏感指數(shù)，胰島素抵抗L02 肝細(xì)胞中CaSR 數(shù)量明顯增加，CaSR 基因及蛋白表達(dá)、AKT 磷酸化（Thr308，Ser473）蛋白表達(dá)明顯升高，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，并且陽性對照組也存在相同趨勢。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平探究花旗澤仁改善2 型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)花旗澤仁能使CaSR 分布、mRNA、蛋白表達(dá)量及磷酸化AKT 活性上調(diào)，可能是通過調(diào)節(jié)CaSR、激活PI3K／AKT 信號通路上AKT 的Thr308 和Ser473 磷酸化位點(diǎn)、影響PI3K 通路所致。