張 凱， 郭明洲， 張志謙

1.北京大學臨床腫瘤學院暨北京市腫瘤防治研究所細胞生物學研究室，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心消化內(nèi)科醫(yī)學部

胰腺癌是所有惡性腫瘤中死亡率最高的一種消化道腫瘤。在世界范圍內(nèi)，胰腺癌的發(fā)病率在過去的30年里增加了1倍多[1]。在我國，胰腺癌是男性和女性癌癥相關(guān)死亡的第六大原因[2]，它正成為越來越常見的癌癥死亡原因，給人類健康事業(yè)帶來巨大負擔和挑戰(zhàn)。胰腺癌的特征是由酸性缺氧的腫瘤微環(huán)境促進糖酵解增強，代謝重編程使癌細胞能夠在惡劣的微環(huán)境中生存[3]。細胞能量代謝異常被發(fā)現(xiàn)和腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，腫瘤細胞代謝已成為癌癥研究的熱門課題。因此，本文主要對胰腺癌在有氧糖酵解方面的研究作一概述，對胰腺癌有氧糖酵解發(fā)生的影響因素和關(guān)鍵酶及針對它們的臨床靶向治療進行歸納總結(jié)。

1 胰腺癌有氧糖酵解發(fā)生的影響因素

1.1 胰腺癌細胞缺氧微環(huán)境胰腺惡性腫瘤細胞通常只占腫瘤組織的極少部分，腫瘤組織中的其他成分由細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、內(nèi)皮細胞、免疫細胞和神經(jīng)元等組成[4]，它們相互作用形成了腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)。TME占腫瘤體積的90%，它對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。大多數(shù)胰腺癌的血管系統(tǒng)非常差，低血供是胰腺癌影像學診斷的突出特征[5]，在胰腺癌中，缺氧和低血供微環(huán)境導致胰腺癌細胞有氧糖酵解增強。此外，胰腺癌的組織學特征是致密的纖維化間質(zhì)，這會使腫瘤血管受到外部機械應力壓迫從而惡化組織灌注，限制腫瘤細胞對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的利用[6]。長期生存在嚴重缺氧和營養(yǎng)剝奪的環(huán)境中對細胞維持代謝穩(wěn)態(tài)和生物大分子合成構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)，胰腺癌細胞通過代謝重編程支持其能量和生物合成需求[7]。

1.2 低氧誘導因子(hypoxia inducible factors，HIFs)HIFs是對腫瘤微環(huán)境和代謝有廣泛影響，并在細胞感知和適應氧含量變化的功能中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。HIF的水平和活性主要由其α亞基控制，常氧條件下HIF-α亞基受脯氨酰羥化酶介導的氧依賴性羥基化作用，促進它被泛素化修飾降解，缺氧抑制羥基化進而維持HIF-α亞基穩(wěn)定性[10-11]。在腫瘤缺氧的微環(huán)境中，HIF-1α可以通過穩(wěn)定上調(diào)己糖激酶Ⅱ(HK2)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和丙酮酸激酶M2(PKM2)等糖酵解酶的表達促進葡萄糖吸收和糖酵解[12-14]。

HIF-1α的高表達已經(jīng)在胰腺癌中證實[5]，根據(jù)Oncomine和TCGA等數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果[15]，在胰腺癌中P4HA1的高表達依賴HIF-1α并提示預后不良。HIF-1α和P4HA1之間存在正反饋通路，P4HA1可以提高HIF-1α的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄活性，并增強其穩(wěn)定性。P4HA1-HIF-1α通路是胰腺癌糖酵解和致癌活性的關(guān)鍵調(diào)控因子，它能驅(qū)動胰腺癌的糖酵解和不良進展，敲低P4HA1顯著抑制了胰腺癌細胞的糖酵解活性和惡性表型[15]。除此之外，在人類胰腺癌組織中，HIF-1α和HIF-2α過表達與乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A，LDHA)過表達具有很強的相關(guān)性[16]，熒光染色結(jié)果顯示，在85%或83% LDHA陽性的胰腺癌樣品中觀察到HIF-1α和HIF-2α陽性染色，但在LDHA陰性的樣品中這個比例只有14%或19%。低氧誘導的LDHA表達依賴于具有HRE-D的啟動子，在低氧條件下，HIF-1α或HIF-2α均與LDHA啟動子中的HRE-D相互作用，抑制內(nèi)源性HIF-1α或HIF-2α可顯著降低缺氧誘導的LDHA水平，進而抑制胰腺癌細胞的糖酵解水平和增殖能力[16]。

1.3 胰腺癌細胞基因突變胰腺癌的發(fā)生很大程度上是由某些致癌基因和抑癌基因的突變導致的，KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4的突變被認為是胰腺癌發(fā)生的主要驅(qū)動因素[17]，這些基因的突變是促進胰腺癌有氧糖酵解的重要原因。一項實驗數(shù)據(jù)表明，約93%的胰腺癌中存在KRAS癌基因突變[18]。胰腺細胞KRAS突變可引起多種代謝重編程，為細胞增殖創(chuàng)造有利環(huán)境，加速癌變進程，MAPK通路和Myc調(diào)控的轉(zhuǎn)錄控制在胰腺癌KRAS突變介導的代謝重編程中起關(guān)鍵作用[19-20]。胰腺癌細胞處于缺氧的環(huán)境中，KRAS激活性突變增強了缺氧誘導的HIF-1α和HIF-2α的穩(wěn)定性，從而導致HIF-1α的下游調(diào)控分子CA9表達水平的升高[21]。在胰腺癌細胞中，CA9的敲低或藥物抑制會損害它們在缺氧時調(diào)節(jié)pHi的能力，潛在地抑制腫瘤生長和擴散，而CA9水平的升高能促進代謝方式向糖酵解的轉(zhuǎn)變[21]。此外，KRASG12D突變通過調(diào)節(jié)葡萄糖攝取和隨后的代謝步驟對葡萄糖利用至關(guān)重要，當胰腺癌細胞中KRASG12D突變表達增加時，伴隨著葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT1)、己糖激酶(HK1、HK2)、磷酸果糖激酶1(PFK1)、烯醇化酶-1(ENO1)和LDHA表達水平的升高，葡萄糖攝取和乳酸生成增加，從而促進胰腺癌糖酵解水平增強[20]。

在約70%的胰腺癌中，腫瘤抑制基因TP53發(fā)生突變，這種突變造成p53突變體蛋白構(gòu)象發(fā)生改變從而獲得癌基因的功能，進一步激活了胰腺癌的侵襲性并改變了胰腺癌細胞的代謝方式[22]。突變型p53不改變糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達水平，但它可以通過增強SIRT1:GAPDH復合體相互作用、抑制AMPK和激活AKT信號通路來抑制GAPDH的核轉(zhuǎn)位，增強GAPDH糖酵解活性和乳酸分泌從而支持胰腺癌細胞的糖酵解。GAPDH胞質(zhì)穩(wěn)定及糖酵解活性有助于突變型p53的致癌作用[22]。

SMAD4是胰腺癌的一種特異性腫瘤抑制基因，據(jù)報道，約50%的胰腺癌中會發(fā)生SMAD4突變[23]。SMAD4的功能缺失突變與腫瘤侵襲、不良進展和較差的預后有顯著相關(guān)性[24-26]。SMAD4表達結(jié)合TGF-β介導的刺激能顯著降低胰腺癌細胞外酸化率并增加氧消耗率，它的缺失導致了胰腺癌的代謝重編程，在胰腺癌細胞中敲低SMAD4增強了胰腺癌細胞糖酵解能力并降低了線粒體功能[27]。SMAD4缺失在胰腺癌發(fā)生和代謝重編程中的作用依賴PGK1，TGF-β/SMAD4信號通路能抑制糖酵解酶PGK1的表達。PGK1在SMAD4缺失誘導的胰腺癌中表達上調(diào)，從而增強胰腺癌的有氧糖酵解和侵襲性行為[27]。

2 胰腺癌有氧糖酵解關(guān)鍵酶

2.1 HK2己糖激酶(Hexokinases，HKs)可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，是調(diào)節(jié)糖酵解的關(guān)鍵酶。HKs由HK1、HK2、HK3和HK4四種亞型組成，它們在不同的組織中呈不同程度表達[28]。與癌旁健康組織相比，HK2在大多數(shù)胰腺癌患者的腫瘤組織中表達上調(diào)[29]。在接受手術(shù)治療的胰腺癌患者中，HK2的表達與較短的總生存期相關(guān)，HK2表達的增加在胰腺癌中促進腫瘤侵襲，而其表達的下調(diào)可抑制腫瘤細胞擴散和向遠處器官的定植[30]。HK2在胰腺癌細胞中的表達受到長鏈非編碼RNA(lncRNA)和microRNA(miRNA)的調(diào)控。lncRNA HOTAIR是胰腺癌中HK2的上游調(diào)節(jié)因子[29]，在胰腺癌腫瘤組織和血清中，HOTAIR和HK2的表達均高于健康對照組，并隨著腫瘤進展表達水平進一步升高。HOTAIR的上調(diào)促進了HK2的表達從而導致胰腺癌細胞中葡萄糖攝取、乳酸和ATP生成的增加，在胰腺癌的惡性進程中發(fā)揮了重要作用[29]。而miR-202在胰腺癌中低表達，它的低表達與胰腺癌患者預后不良相關(guān)。在胰腺癌組織中，miR-202的表達與HK2水平呈負相關(guān)，HK2是miR-202的直接靶點，miR-202通過抑制HK2的表達抑制胰腺癌細胞糖酵解和增殖能力，進而抑制胰腺癌的進展[31]。

2.2 PGK1磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase，PGK)是一種產(chǎn)生能量的糖酵解酶，它催化磷酸基從1，3-二磷酸甘油酯(BPG)轉(zhuǎn)移到ADP，產(chǎn)生3-磷酸甘油酸(3PG)和ATP[32]。PGK不僅在糖酵解中發(fā)揮作用，而且還作為二硫化物還原酶參與血管生成過程[33]。PGK1和PGK2同工酶在結(jié)構(gòu)和功能上是相似的[34]，PGK2僅在精子形成過程中表達，缺乏PGK2的雄性精子的活力和ATP水平顯著降低[35]。PGK1作為一種蛋白激酶在協(xié)調(diào)糖酵解和三羧酸循環(huán)中發(fā)揮重要作用，它可以被O-GlcNAc糖基化可逆地動態(tài)修飾，O-GlcNAc糖基化激活PGK1活性并誘導PGK1轉(zhuǎn)位到線粒體。在線粒體內(nèi)PGK1作為一種激酶激活丙酮酸脫氫酶激酶1(PDHK1)磷酸化并抑制丙酮酸脫氫酶(PDH)復合物，降低線粒體丙酮酸利用率以減少氧化磷酸化，同時增加乳酸的產(chǎn)生[36-37]。在胰腺癌患者腫瘤組織切片樣本中PGK1蛋白水平升高，胰腺癌患者的血清PGK1水平也明顯高于健康對照組，這表明PGK1可能是胰腺癌的一種新的血清標志物[38]。PGK1的表達受轉(zhuǎn)錄因子NFAT5的調(diào)控，在NFAT5敲低的胰腺癌細胞系中PGK1表達水平顯著降低[39]。通過TCGA等數(shù)據(jù)庫分析和免疫組化驗證表明，在胰腺癌中NFAT5高表達，并與較差的預后相關(guān)。NFAT5通過增強胰腺癌細胞的糖酵解作用調(diào)控胰腺癌進展，而PGK1是NFAT5主要靶基因之一，NFAT5通過PGK1的轉(zhuǎn)錄表達促進有氧糖酵解因而有利于胰腺癌細胞的生存[39]。

2.3 PKM2丙酮酸激酶(Pyruvate kinases，PK)催化ADP和磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為ATP和丙酮酸，是催化糖酵解最后一步的酶，它共有四種同工酶，分別為PKM1、PKM2、PKL和PKR[40]。PKM1和PKM2的表達均影響胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力，但在異種移植瘤模型中，只有抑制PKM2才能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[41]。胰腺癌細胞中PKM2的表達高于臨近非癌組織，其在胰腺癌細胞的代謝活動和惡性過程中起著重要作用，敲低PKM2會導致糖酵解活性降低，并降低一些細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物如丙酮酸和多胺的水平[42]。PKM2是胰腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子，它通過磷酸化PAK2和促進PAK2-HSP90的關(guān)聯(lián)來穩(wěn)定PAK2，從而提高胰腺癌的細胞侵襲能力并促進腫瘤轉(zhuǎn)移[41]。最新研究表明[43]，胰腺癌中PKM2的表達也受lncRNA的調(diào)控，lncRNA MIR210HG在胰腺癌組織中表達顯著高于非癌健康組織，高表達MIR210HG的胰腺癌患者可能表現(xiàn)出更差的預后。MIR210HG是調(diào)控胰腺癌侵襲性和糖酵解的關(guān)鍵因子，它通過調(diào)控miR-125b-5p/HK2/PKM2通路調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的侵襲性和糖酵解水平。MIR210HG的表達與HK2和PKM2的表達呈正相關(guān)，MIR210HG下調(diào)會降低HK2和PKM2的表達，導致葡萄糖攝取和乳酸分泌下降，從而抑制胰腺癌細胞糖酵解水平[43]。

2.4 LDHA血清乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)水平能預測晚期胰腺癌吉西他濱化療后的總生存期[44]。LDH有LDHA和LDHB兩種亞型[45]，LDHA促進丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸而不是進入三羧酸循環(huán)[46]，它在糖酵解性腫瘤如胰腺癌中過表達，并與不良預后相關(guān)[47]，異常的LDHA表達水平是胰腺癌一個潛在的診斷標志[48]。LDHA通過HIF信號調(diào)節(jié)TME，LDH缺失可以通過改變TME來調(diào)節(jié)免疫反應，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移并延長小鼠的生存期[49]。

LDHA也通過與其他分子共同作用調(diào)控胰腺癌細胞有氧糖酵解。FOXM1是一種致癌轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXM1直接與LDHA啟動子區(qū)結(jié)合，F(xiàn)OXM1的過表達增加了LDHA在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達。增強的FOXM1-LDHA信號促進胰腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，并增加了乳酸的生成和葡萄糖的利用，對胰腺癌的有氧糖酵解和發(fā)生發(fā)展起著重要作用[50]。UCHL3在胰腺癌組織標本和細胞系中表達上調(diào)，并通過上調(diào)FOXM1的表達促進LDHA的表達，最終促進胰腺癌的發(fā)展。抑制UCHL3可以抑制胰腺癌細胞的增殖和有氧糖酵解，它可以作為預測胰腺癌進展的生物標志物[51]。免疫組化和qRT-PCR結(jié)果表明[52]，c-Myc和LDHA在胰腺癌中表達呈正相關(guān)，它們在胰腺癌細胞系和組織中均為高表達，胰腺癌患者c-Myc和LDHA高表達與TNM分期和腫瘤大小相關(guān)，常提示預后不良。異常調(diào)控的c-Myc-LDHA信號與腫瘤進展密切相關(guān)，并在胰腺癌的有氧糖酵解調(diào)控中發(fā)揮重要作用，敲低c-Myc降低了LDHA蛋白的表達和糖酵解水平，抑制c-Myc-LDHA通路誘導的有氧糖酵解能抑制胰腺癌進展[52]。

3 有氧糖酵解與胰腺癌治療

有氧糖酵解不僅是多種腫瘤發(fā)生的危險因素，還與腫瘤的預后較差有關(guān)，腫瘤缺氧和有氧糖酵解是降低抗腫瘤治療效果的重要因素[53]。因為糖酵解在細胞基礎代謝中發(fā)揮了重要作用，靶向糖酵解治療成了一個難題，尋找腫瘤細胞糖酵解的有效治療靶點仍然非常困難[54-55]。針對胰腺癌有氧糖酵解的靶向治療必須保證代謝過程或糖酵解酶的抑制對細胞正常功能不會造成損傷，目前對此已經(jīng)有了相關(guān)研究。

胰腺癌缺氧反應的主要調(diào)節(jié)因子HIF是抗癌治療的潛在靶點，多種針對HIF-1的治療方法已經(jīng)在研究。例如EZN-2968是一種特異性靶向HIF-1α的反義寡脫氧核苷酸，它在難治性實體瘤患者中進行了臨床試驗以評估其抗腫瘤效應[56]。抑制HIF的下游效應物，如HO-1，是另一種可能的靶向缺氧的治療策略。HO-1是一種應激相關(guān)酶，缺氧誘導的HO-1轉(zhuǎn)錄激活被證明是由HIF-1介導的。HO-1的高表達與胰腺癌患者的不良預后顯著相關(guān)，抑制HO-1可顯著抑制胰腺癌細胞增殖，HO-1抑制聯(lián)合吉西他濱治療顯著增強了腫瘤化療的效果[57]。

IKA是一種自然產(chǎn)生并具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等藥理作用的抗生素[58]。轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學的整合揭示了IKA可能通過阻斷糖酵解來影響腫瘤代謝，HK2是IKA的作用靶點，IKA可以通過其親水基團與HK2殘基Glu742、Gln739、Glu708和Gln683形成5個氫鍵。通過靶向HK2阻斷糖酵解，IKA減少葡萄糖消耗和乳酸生成，它在胰腺癌異種移植小鼠中抑制了腫瘤生長而無明顯的細胞毒性，并在體外胰腺癌細胞中增強了吉西他濱的化療敏感性，這提示IKA可能是胰腺癌治療的潛在候選藥物[58]。

胰腺癌細胞同時表達PKM2和LDHA，靶向糖酵解酶PKM2和LDHA從而抑制糖酵解也是一種很有前途的治療胰腺癌的方法。PKM2激活劑TEPP-46和LDHA抑制劑FX-11處理后，血漿和腫瘤組織中PKM2酶活性升高，LDHA酶活性降低，而免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織中PKM2和LDHA表達水平均降低。兩者聯(lián)合治療可協(xié)同降低胰腺癌細胞增殖速率和生存能力，顯著抑制小鼠移植瘤的生長并對小鼠的體質(zhì)量、肝酶功能等無不良影響，具有良好的安全性[59]。

4 結(jié)論與展望

胰腺癌特殊的缺氧微環(huán)境及KRAS、TP53和SMAD4等基因的突變是導致胰腺癌有氧糖酵解發(fā)生的重要原因，糖酵解過程中HK2、PGK1、PKM2和LDHA等關(guān)鍵酶的異常表達促進了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。目前，針對胰腺癌有氧糖酵解的靶向治療的基礎研究很多，包括針對胰腺癌常見的突變基因、TME和有氧糖酵解的關(guān)鍵酶等，但真正推進到臨床治療并取得顯著療效的研究并不多。未來努力的方向應該更加重視有氧糖酵解在胰腺癌臨床治療方面的研究，以降低抑制有氧糖酵解的靶向治療對正常細胞功能的損傷。相信隨著對胰腺癌有氧糖酵解機制更深入的理解，會有更多安全有效的治療靶點和治療方法會被發(fā)現(xiàn)，以提高胰腺癌患者的生活質(zhì)量和生存率。