張晶，許凱，梁麗娜，莊曾淵，梁潔

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）屬于視網(wǎng)膜變性類疾病的范疇，是嚴重威脅視力的致盲性眼病，患者多為50 歲以上人群，并且隨著年齡增加發(fā)病率也逐漸升高。在我國經(jīng)濟發(fā)展程度較高的城市，AMD 甚至已成為老年人群致盲性眼病的第2 位原因[1]。根據(jù)臨床特點的不同，AMD 可分為滲出性（濕性）和非滲出性（干性）。對于濕性AMD 的治療隨著抗新生血管藥物的使用已取得了較好的臨床效果。但對于干性AMD 引起的視力喪失，目前仍缺乏有效的治療藥物。

中醫(yī)辨證論治和整體治療的理念為AMD 的治療提供了新的思路[2]。一項關(guān)于中藥治療干性AMD療效meta 分析的結(jié)果顯示，中藥治療后，患者視力以及視覺誘發(fā)電位振幅都有明顯改善[3]。固本清目方是莊曾淵研究員臨床治療AMD 的基本方，臨床初步觀察顯示有較好的效果，為進一步明確固本清目方保護AMD 的作用及機制，本實驗模擬AMD 發(fā)生的高危因素建立小鼠AMD 模型，觀察固本清目方對實驗性視網(wǎng)膜變性的保護作用，并就其相關(guān)機制進行探討，為固本清目方的臨床應用提供理論依據(jù)及支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4 月齡健康雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠60 只（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]。實驗動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院實驗動物中心屏障級動物房內(nèi)[SYXK（京）2019-0049]。溫度（22±5）℃，濕度（50±5）℃。所有實驗操作遵循《北京市實驗動物管理條例》，并按實驗動物3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 試劑與儀器

固本清目方水煎劑（組成：枸杞子，當歸，刺五加，郁金，山梔子，由中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院藥劑科煎制），煎制濃縮到0.6 g/ml；氫醌（Sigma-Aldrich，H9003）；TUNEL 細胞原位凋亡試劑盒（Roche Life Science，12156792910）；HE 染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，C02-04004）；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，BD PharmingenTM，564907）；抗熒光淬滅劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，C-101）；DNA 酶I（大連TaKaRa 公司，D2270A）；冰凍包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT，美 國SAKURA Sakura 公司，4583）；4%多聚甲醛（北京Unique 生物科技有限公司，P1110）；Fas（Abcam，ab216991）；FasL（Abcam，ab15285）；羅丹明標記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZF0316）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA,北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-2315）。熒光定量PCR（qualitative real-time PCR，RT-PCR）試劑盒（TAKAR寶生物工程(大連)有限公司，DRR820A），引物（上海生物工程公司），SuperScript III 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（ThermoFisher，12574018）小動物視覺電生理檢測儀（Diagnosis，D430），光學顯微鏡（Leica，DM2500）,冰凍切片機（Leica，CM1850），光照度計（北京師范大學光電儀器廠，ST-85），大鼠SPF 級生長繁育飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司），實驗性慢性視網(wǎng)膜光損傷裝置（自主設計研發(fā)，實用新型專利證書號：ZL201721043922.6）。

1.3 動物模型的建立與分組

4 月齡C57BL/6J 小鼠40 只，每日喂以含8g/（kg.bw）氫醌的飼料，同時每日接受12 h、強度2500 lux 的光照以建立視網(wǎng)膜變性模型[4]。3.5 個月后，將小鼠隨機分為中藥組、模型組，每組20 只。中藥組小鼠每日給予0.6 kg/kg 固本清目方0.3 ml 灌胃1 次；模型組小鼠每日給予同體積蒸餾水灌胃1 次。取正常未干預C57BL/6J 小鼠20 只作為正常組，常規(guī)飼養(yǎng)作為對照。

1.4 視網(wǎng)膜電圖檢測

各組小鼠于檢測前暗適應24 h，復方托吡卡胺滴眼液點雙眼常規(guī)散瞳20 min；采用鹽酸氯胺酮-鹽酸塞拉嗪混合麻醉劑（比例為1∶7）肌注（0.01 ml/kg）麻醉小鼠。視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）檢測操作全程均在弱紅光燈下進行操作。將雙側(cè)角膜電極置于小鼠雙側(cè)眼角膜正中，保持各電極間阻抗始終＜5 kΩ。根據(jù)國際臨床視覺電生理協(xié)會（ISCEV）制定的最新國際標準[5]，依次選定視桿細胞反應，最大反應，暗適應震蕩電位，（自動明適應5 min）視錐細胞反應以及10 Hz 閃爍光反應進行檢測。依次記錄各組振幅值（μV）。

1.5 組織病理學檢查

于干預后14 d 及28 d，每組分別頸椎脫臼法處死3 只小鼠用于病理學檢查，快速摘取眼球，1 ml 注射器角膜穿刺置于4%多聚甲醛固定20 min，解剖顯微鏡下小心去除眼前節(jié)和部分玻璃體，余下組織繼續(xù)固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋。連續(xù)4 μm 切片，切片常規(guī)脫蠟至水后行HE 染色，光學顯微鏡觀察視網(wǎng)膜各層病理改變。

1.6 TUNEL 檢測視網(wǎng)膜細胞凋亡

于干預后14 d 及28 d，每組分別處死3 只小鼠制作眼球冰凍切片，小鼠眼球取材同HE 染色，4%多聚甲醛液中4℃固定24 h 后，冰凍包埋劑OCT 包埋后液氮冷凍。冰凍切片機-23℃下行垂直視網(wǎng)膜的8 μm 冰凍切片。冰凍切片磷酸緩沖液（PBS）室溫15 min×3 次洗脫包埋劑，進行TUNEL 檢測，具體操作參見試劑盒說明，完成后進行DAPI 復染細胞核，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每組隨機選取10 張片子，每張片子計數(shù)一個高倍視野下凋亡的感光細胞數(shù)及感光細胞總數(shù)。計算凋亡率，凋亡率=（凋亡陽性細胞數(shù)）/（視網(wǎng)膜總細胞數(shù)）×100%。

1.7 Fas 及FasL 的表達

免疫熒光檢測：將冰凍切片置于磷酸緩沖液（PBS）室溫10 min×3 次，然后置于1% TritonX-100溶液30 min，2%牛血清白蛋白的室溫封閉2 h 后滴加分別一抗Fas、FasL，4℃孵育過夜。PBS 溶液室溫洗滌10 min×3 次，滴加羅丹明標記的山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h，PBS 清洗10 min×3 次，DAPI 復染細胞核5 min?？篃晒馑p封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

RT-PCR 檢測Fas 及FasL mRNA 的表達：于干預后14 d 及28 d，每組分別處死4 只小鼠用于RT-PCR 檢查，采用Trizol 法提取視網(wǎng)膜組織總RNA，參照試劑盒SuperScriptTM III 提供的操作方法，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，紫外分光光度計測定其濃度。引物序列見表1。常規(guī)PCR 操作擴增程序檢測Fas、FasL 的mRNA 表達水平。數(shù)據(jù)進行2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換后，進行分析比較。

表1 RT-PCR 引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 軟件包進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗后，對符合正態(tài)分布的兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t 檢驗；多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組視網(wǎng)膜電圖（ERG）比較

14 d：（1）與正常組比較，中藥組10 Hz 閃爍光反應降低（t=7.360，P=0.000），但視桿細胞反應、最大反應、暗適應震蕩電位以及視錐細胞反應各項差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（2）中藥組與模型組比較，視桿細胞反應（t=2.937，P=0.022）、最大反應（t=3.153，P=0.016）、暗適應震蕩電位（t=3.597，P=0.009）、視錐細胞反應（t=2.988，P=0.020）振幅均升高，差異均有統(tǒng)計學意義，但在10 Hz 閃爍光反應方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 干預14 d 時各組小鼠ERG 結(jié)果比較（，n=10）

表2 干預14 d 時各組小鼠ERG 結(jié)果比較（，n=10）

注：▲與正常組比較，P＜0.05；◆與中藥組比較，P＜0.05。ERG 視網(wǎng)膜電圖

28d：（1）與正常組比較，中藥組最大反應（t=13.229，P=0.000）、10 Hz 閃爍光反應（t=10.651，P=0.000）振幅值均降低，差異均有統(tǒng)計學意義。但視桿細胞反應、暗適應震蕩電位、視錐細胞反應各項，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（2）中藥組與模型組比較，視桿細胞反應（t=4.687，P=0.002）、暗適應震蕩電位（t=3.371，P=0.012）、視錐細胞反應（t=4.176，P=0.004）振幅仍升高，差異均有統(tǒng)計學意義；而最大反應、10 Hz 閃爍光反應的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

表3 干預28 d 各組小鼠ERG 結(jié)果比較（，n=10）

表3 干預28 d 各組小鼠ERG 結(jié)果比較（，n=10）

注：▲與正常組比較，P＜0.05；◆與中藥組比較，P＜0.05。ERG 視網(wǎng)膜電圖

2.2 組織病理學

HE 染色顯示，正常組小鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細胞形態(tài)均一，視網(wǎng)膜色素上皮（retina pigment epithelium，RPE）細胞呈單層連續(xù)排列（圖1A、1D）。與正常組相比，模型組小鼠RPE 層呈現(xiàn)萎縮樣改變（圖1B、1E），中藥組小鼠RPE 細胞排列較規(guī)整，色素均勻分布于細胞內(nèi)，Bruch 膜結(jié)構(gòu)相對完整，（圖1C、1F）。14 d 時，中藥組的視網(wǎng)膜感光細胞個數(shù)（231.67±9.71）較模型組（203.67±10.26）顯著升高（t=6.346，P=0.000），而與正常組（235.33±17.00）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；28 d 時，中藥組感光細胞個數(shù)（182.67±12.12）仍顯著高于模型組（176.67±36.17）（t=5.827，P=0.001），而與正常組（213.33±15.00）的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 小鼠視網(wǎng)膜病理圖像觀察（HE 染色×400）。1A 正常組14 d；1B 模型組14 d；1C 中藥組14 d；1D 正常組28 d；1E 模型組28 d；1F 中藥組28 d

2.3 TUNEL 法觀察各組小鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡

TUNEL 染色結(jié)果顯示，正常組視網(wǎng)膜罕見凋亡細胞（圖2A、2D），14 d 及28 d 時，中藥組（圖2C、2F）和模型組（圖2B、2E）均可見凋亡陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光（圖2B），主要分布于視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層及RPE 細胞層。14 d 時，中藥組凋亡率（16.00±2.34）%明顯低于模型組（43.00±2.17）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.714，P=0.030）；28 d 時，中藥組與模型組細胞凋亡率分別為（7.00±2.35）%和（36.00±2.13）%，差異具有統(tǒng)計學意義（t=3.231，P=0.014）。

圖2 TUNEL 法檢測各組小鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡（TUNEL 染色×400）。2A 正常組14 d；2B 模型組14 d；2C 中藥組14 d；2D 正常組28 d；2E 模型組28 d；2F 中藥組28 d

2.4 免疫熒光檢測各組視網(wǎng)膜組織Fas 及FasL 的表達

Fas：正常組視網(wǎng)膜中可見少量Fas 蛋白表達，呈紅色熒光，主要分布在RPE 層（圖3A，3D），14 d時，中藥組Fas 蛋白表達趨勢與正常組類似，主要集中于RPE 層（圖3C），而模型組Fas 表達較正常組增強，RPE 層可見到明顯的陽性信號（圖3B）。28 d時，中藥組（圖3F）和模型組（圖3E）Fas 蛋白表達均較14 d 時減弱，但表達分布趨勢與14 d 相似。

圖3 免疫熒光檢測各組小鼠視網(wǎng)膜Fas 表達情況（×400）。3A 正常組14 d；3B 模型組14 d；3C 中藥組14 d；3D 正常組28 d；3E 模型組28 d；3F 中藥組28 d

FasL：正常組可見FasL 少量表達（圖4A，4D），呈紅色熒光，主要分布在RPE 層。14 d 時，模型組表達較正常組增強，在RPE 層和感光細胞內(nèi)核層均可見到紅色熒光信號（圖4B）；中藥組僅在RPE層可見少量表達（圖4C）。28 d 時，中藥組（圖4F）和模型組（圖4E）FasL 的表達分布于14 d 時相近，在RPE 層以及內(nèi)核層均可見陽性信號，中藥組表達弱于模型組。

圖4 免疫熒光檢測各組小鼠視網(wǎng)膜FasL 表達情況（×400）。4A 正常組14 d；4B 模型組14 d；4C 中藥組14 d；4D 正常組28 d；4E模型組28 d；4F 中藥組28 d

2.5 RT-PCR 檢測各組視網(wǎng)膜組織Fas 及FasL mRNA 的表達

Fas：14 d 時，中藥組Fas 表達較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.153，P=0.000）；中藥組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；28 d 與14 d 趨勢相近，中藥組表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.204，P=0.000），而與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 RT-PCR 檢測各組Fas、FasL mRNA 的表達情況。5A FasmRNA的表達；5B FasL mRNA 的表達

FasL：14 d 時，中藥組FasL 表達低于模型組（t=8.372，P=0.000），而與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；28 d 時，中藥組FasL 表達仍低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.011，P=0.000），而與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

目前AMD 具體發(fā)病機制尚不十分明確，但大量研究顯示AMD 一個多因素作用、光感受器細胞、RPE 細胞和脈絡膜毛細血管之間相互影響形成的復雜系統(tǒng)的表現(xiàn)。因此，聯(lián)合多種發(fā)病誘因，盡可能模擬AMD 發(fā)生的環(huán)境因素，可能會建立更接近人AMD 發(fā)病機制的動物模型。年齡、吸煙及光損傷是AMD 發(fā)生的重要誘因[6-7]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，處于吸煙環(huán)境的老齡小鼠視網(wǎng)膜色素上皮層下出現(xiàn)沉積物、Bruch 膜層膠原增厚及RPE 細胞凋亡，與人AMD早期病理改變相似[8]。另1 項動物實驗顯示：利用可見光持續(xù)照射2 月齡豬3 個月以上，多焦視網(wǎng)膜電圖、光鏡、電鏡觀察證實視網(wǎng)膜發(fā)生了變性損傷，光損傷部位主要在光感受器細胞[9]。上述模型分別以吸煙、光照2 個AMD 危險因素模擬出部分AMD 病理改變，本課題組前期將老齡、吸煙（氫醌為香煙中的有害成分）、可見光持續(xù)照射三因素聯(lián)合建立小鼠AMD 模型，觀察到小鼠視網(wǎng)膜變化與臨床AMD的病變特點更加接近[4]。因此本研究仍采用此種模型小鼠，觀察固本清目方對AMD 的干預作用。

AMD 在中醫(yī)眼科屬“視瞻昏渺”“視直如曲”等病證范疇。雖然臨床上所見證型復雜，但其主要病機是由于機體老化，五臟皆虛，脾腎為重。一方面脾腎虛衰致精血不足，真元耗傷，精氣不能上榮于目，則目失濡養(yǎng)而目視不明；另一方面脾腎功能衰弱，則水濕運化無度，氣機不利，清陽不升，濁陰不降，痰濁之邪內(nèi)生，加之長期光照、吸煙等外邪刺激皆能化火，耗傷氣血，使痰濕積聚加重，變生玻璃膜疣、滲出、水腫等導致AMD 發(fā)生。

固本清目方組成包括枸杞子、黃芪、當歸、刺五加、郁金、山梔，其中枸杞子補腎填精，黃芪、當歸益氣養(yǎng)血，刺五加補腎益氣，郁金、山梔行氣解郁，諸藥合用，共奏補腎固本、行氣解郁功效?，F(xiàn)代藥理學研究顯示，組方中刺五加水提取物能夠有效清除自由基，減輕缺血-再灌注過程中過氧化引起的線粒體損傷[10]，對胰腺細胞急性炎癥損傷所致的凋亡和自噬等具有確切保護作用[11];此外，刺五加功能成分可改善輻射造成的小鼠腦組織細胞的損傷，具體機制與其黃酮及皂苷等減少輻射小鼠大腦皮質(zhì)與海馬組織的細胞空洞,提高存活神經(jīng)元數(shù)量密切相關(guān)[12]。組方中的枸杞子富含枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP），研究證實枸杞子及LBP 對角膜損傷、視網(wǎng)膜色素變性、AMD 以及糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種眼科疾病的防治均具有一定效果。此外在輻射所致的大鼠海馬神經(jīng)元損傷模型中，LBP 通過增加SOD、Bcl-2 的含量、抑制caspase-3 蛋白表達水平，實現(xiàn)對神經(jīng)元細胞的保護作用[13-18]；組方中黃芪的功能成分黃芪多糖對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的炎癥損傷以及凋亡均具有保護作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，固本清目方干預14 d 及28 d 后，小鼠ERG 中視桿細胞反應、暗適應震蕩電位、視錐細胞反應的振幅顯著高于模型組，視網(wǎng)膜病理結(jié)果顯示中藥組小鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層細胞數(shù)量高于模型組，表明固本清目方對模型小鼠視網(wǎng)膜視桿細胞和視錐細胞的結(jié)構(gòu)和功能具有維持和改善作用。

Fas 蛋白為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis family receptor，TNFR）家族成員，F(xiàn)asL 為Fas 的配體，屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis family，TNF）家族[21]。生理狀態(tài)下，F(xiàn)asL 存在于虹膜、睫狀體、脈絡膜以及視網(wǎng)膜等眼部組織中[22]，在損傷、炎癥、缺血等因素刺激下活化，與FAS+的細胞結(jié)合，介導細胞凋亡過程[23]。本研究中，RT-PCR 及免疫熒光結(jié)果顯示固本清目方可以抑制AMD 模型小鼠視網(wǎng)膜組織中Fas/FasL 的表達及分泌，TUNEL 結(jié)果顯示中藥組凋亡陽性細胞顯著低于模型組，提示固本清目方可能通過調(diào)控Fas/FasL 介導的細胞凋亡通路，抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡從而發(fā)揮保護作用。

綜上所述，本研究從形態(tài)學及功能學角度證實固本清目方對實驗性小鼠AMD 具有較好的保護作用，并發(fā)現(xiàn)其機制與調(diào)節(jié)Fas/FasL 的表達，進而抑制Fas/FasL 介導的視網(wǎng)膜細胞凋亡有關(guān)。在今后的工作中，一方面需要開展規(guī)范的臨床試驗，為固本清目方的臨床推廣提供高質(zhì)量的循證依據(jù)；另一方面進一步深入揭示其作用機制，為固本清目方的應用提供理論支持。