史永惠，丁 華，郭 慧，王艷霞，孟美英，呂彩蓮

(鄂爾多斯市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010)

隨著我市地區(qū)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，藥品種類(lèi)越來(lái)越多，及時(shí)有效地進(jìn)行藥品微生物檢驗(yàn)已成為一項(xiàng)重大任務(wù)。許多藥品中含有抑菌活性成分，按常規(guī)檢驗(yàn)法控制藥品中微生物污染通常會(huì)由于抑菌成分存在微生物生長(zhǎng)可能被抑制，其結(jié)果不能真實(shí)反映其微生物的污染狀況，勢(shì)必影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性可靠性，所以對(duì)藥品進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)就必須對(duì)受檢樣品開(kāi)展方法學(xué)研究，采用適宜的方法，將含抑菌成分的樣品消除抑菌活性后，微生物檢驗(yàn)結(jié)果才能真實(shí)反映出藥品的實(shí)際污染情況。本試驗(yàn)按文獻(xiàn)[1]規(guī)定的微生物檢驗(yàn)法，對(duì)麻黃堿苯海拉明片進(jìn)行了方法適用性試驗(yàn)研究，確立了可行的微生物檢驗(yàn)方法，且方法簡(jiǎn)便有效，對(duì)該藥品質(zhì)量起到很好的監(jiān)督查驗(yàn)控制作用。

1 試驗(yàn)儀器及材料

1.1 儀器

HTY-2000集菌儀、反復(fù)使用集菌培養(yǎng)器(杭州泰林醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試驗(yàn)菌株

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]，黑曲霉[CMCC(F)98003]，大腸埃希菌[CMCC(B)44102]由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.3 試劑、稀釋劑

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無(wú)菌氯化鈉由本中心配制，試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 樣品

麻黃堿苯海拉明片(三批)由內(nèi)蒙古億利能源股份有限公司藥業(yè)分公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 常規(guī)法

2.1.1菌液對(duì)照組

接種銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng)2～3天，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng)5～7天，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的菌懸液。分別取菌液1mL和稀釋液1mL注入平皿內(nèi)，每種菌平行制備2個(gè)平皿，用相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，取平均值，測(cè)定出菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

2.1.2試驗(yàn)組

供試品10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL，制成1∶10供試液備用。用移液管準(zhǔn)確量取供試液1mL和1mL已制備好的菌液，注入同一平皿，迅速侵入15～20 mL的相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基(45℃左右)，待凝，每個(gè)菌株制備2個(gè)平皿。需氧菌在30～35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24小時(shí)；霉菌和酵母菌在20～25℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7天，菌落計(jì)數(shù)，取平均值。測(cè)定出試驗(yàn)組菌落數(shù)。

2.1.3供試品對(duì)照組

按試驗(yàn)組方法，以稀釋液代替菌液，測(cè)定供試品對(duì)照組菌落數(shù)。

2.1.4樣品微生物的回收

試驗(yàn)組的菌回收=

計(jì)算回收值，常規(guī)法的回收值見(jiàn)表1，由結(jié)果可知，采用常規(guī)法檢查供試品，3次獨(dú)立試驗(yàn)5種菌株回收值都小于0.5，不能滿(mǎn)足回收值在0.5～2范圍內(nèi)，因此常規(guī)法不能用于需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)檢查。

表1 常規(guī)法的回收值試驗(yàn)結(jié)果

2.2 培養(yǎng)基稀釋法

2.2.1菌液對(duì)照組

同2.1.1 2.1.2 試驗(yàn)組

取上述2.1.2中1∶10倍供試液0.2mL·皿-1，分別與已制備好的菌液1 mL注入同一平皿，迅速倒入15～20mL相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)菌株制備2個(gè)平皿培養(yǎng)計(jì)數(shù)，取平均值。

2.2.2供試品對(duì)照組

按試驗(yàn)組方法，以稀釋液代替菌液，測(cè)定供試品對(duì)照組菌落數(shù)。

2.2.3樣品微生物的回收

方法同2.1.4，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2結(jié)果可知，通過(guò)培養(yǎng)基稀釋法，可消除本品對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的部分抑制作用，回收值有大于0.5的頻次，但其回收值還未全部達(dá)到0.5～2范圍內(nèi)，因此培養(yǎng)基稀釋法也不能用于需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)檢查。

表2 培養(yǎng)基稀釋法的回收值試驗(yàn)結(jié)果

2.3 薄膜過(guò)濾法

由上述常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法結(jié)果可知，本品含強(qiáng)抑菌成分，建議采用薄膜過(guò)濾法對(duì)其進(jìn)行相關(guān)操作。

2.3.1需氧菌、霉菌和酵母菌檢驗(yàn)方法研究

2.3.1.1菌液對(duì)照組 取2.1.1中制備好的1mL菌液和1mL稀釋液分別注入平皿中，每種菌平行制備2個(gè)平皿，用相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，取平均值，測(cè)定出菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

2.3.1.2試驗(yàn)組 取2.1.2已制備的供試液10mL于滅菌離心管中，以500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取上清液1mL加至適量的稀釋劑中過(guò)濾，分別用200mL和300mL稀釋液對(duì)比沖洗，在最后一次沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，抽干后取出濾膜，菌面朝上貼于培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)。

2.3.1.3供試品對(duì)照組 取2.1.2已制備的供試液10mL于滅菌離心管中，以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液1mL加至適量的稀釋劑中過(guò)濾，分別用200mL和300mL稀釋液對(duì)比沖洗，抽干后取出濾膜，菌面朝上貼于培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同沖洗量下敏感試驗(yàn)菌的回收值

從表3結(jié)果可見(jiàn)，300mL沖洗液的除抑菌成分效果明顯優(yōu)于200mL的沖洗效果，采用薄膜過(guò)濾法(300mL沖洗液)，可消除本品對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的抑制作用，使其回收值均達(dá)到0.5～2范圍內(nèi)，因此薄膜過(guò)濾法(300mL沖洗液)，適用于該藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢驗(yàn)。

2.3.2控制菌檢驗(yàn)方法的研究

本品的控制菌要求為每1g中不得檢出大腸埃希菌，故陽(yáng)性菌對(duì)照選用大腸埃希菌。按《中國(guó)藥典》2020年版四部做供試液制備和菌液制備并進(jìn)行相關(guān)操作。

大腸埃希菌適用性試驗(yàn) 采用薄膜過(guò)濾法，取2.1.2已制備的供試液10mL于滅菌離心管中，以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液 1mL 加至適量的稀釋劑中過(guò)濾，用300mL稀釋液沖洗，在最后一次沖洗液中加入50～100cfu大腸埃希菌，抽干后取出濾膜，放入100mL麥康凱液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4結(jié)果可知，試驗(yàn)組均檢出試驗(yàn)菌，可以確認(rèn)采用的離心集菌薄膜過(guò)濾法(300mL沖洗液)適用于該藥品的控制菌檢查。

表4 大腸埃希菌控制菌試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

通常，當(dāng)藥品生產(chǎn)條件發(fā)生改變(如更換產(chǎn)地、更換輔料、改變生產(chǎn)工藝等)或檢測(cè)條件發(fā)生改變(更換檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室等)時(shí)，對(duì)微生物檢驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行再驗(yàn)證[1-2]。由于進(jìn)行再驗(yàn)證時(shí)藥品中的活性成分未發(fā)生改變，故其抗菌譜也未改變，因此建議僅需針對(duì)藥典規(guī)定的全部敏感菌株中最敏感菌株，而不必對(duì)全部菌株再進(jìn)行驗(yàn)證，從而可以有效地節(jié)省大量人力、物力，將使得驗(yàn)證工作作為日常檢驗(yàn)的一部分成為可能。

根據(jù)上述研究結(jié)果可知，300mL的稀釋劑即可消除麻黃堿苯海拉明片樣品溶液中的主要抑菌成分，薄膜過(guò)濾法可用于需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的檢驗(yàn)；驗(yàn)證試驗(yàn)中最敏感菌株是枯草芽孢桿菌，此方法適用性試驗(yàn)將為麻黃堿苯海拉明片微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。