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        尿石素A改善高糖致血管內(nèi)皮損傷的作用與機(jī)制

        2021-03-07 09:11:54鄧智琴楊永健
        嶺南心血管病雜志 2021年1期
        關(guān)鍵詞:高糖孵育內(nèi)皮

        鄧智琴,楊永健,2

        (1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,成都 610000;2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科,成都 610083)

        糖尿病是一種慢性進(jìn)展性內(nèi)分泌疾病,持續(xù)高糖及長期代謝紊亂可致血管病變[1],而動脈粥樣硬化的加速形成是血管病變的基礎(chǔ),其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。研究表明,氧化應(yīng)激是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的重要致病機(jī)制[2],高糖可造成活性氧簇的大量積累,超過內(nèi)源性抗氧化酶的清除能力,形成氧化應(yīng)激狀態(tài)并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷是防治糖尿病血管病變的關(guān)鍵途徑[3]。

        腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是參與細(xì)胞脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶,與糖尿病患者的氧化應(yīng)激、胰島素抵抗和自噬等密切相關(guān)[4-5],其失調(diào)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙中起關(guān)鍵作用[6-7]。尿石素A(uro?lithin A,UA)是人體攝入主要由富含鞣花單寧的食物(石榴、草莓、核桃等)經(jīng)體內(nèi)腸道代謝產(chǎn)生,除了在抗炎、誘導(dǎo)自噬方面發(fā)揮積極的生物功效[8-10],其抗氧化作用在急性腎損傷[11]、心肌缺血再灌注損傷[9]、神經(jīng)退行性疾?。?2]等相關(guān)研究中也已明確證實(shí),并且可以通過激活A(yù)MPK 發(fā)揮對阿爾茲海默病神經(jīng)元的保護(hù)作用[13]。但UA 在糖尿病血管病變中的作用,以及其作用是否與AMPK/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)通路的激活有關(guān)暫無報(bào)道。為此,本研究通過高糖培養(yǎng)基處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株模擬高糖損傷,以研究UA 對高糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平和血管內(nèi)皮功能的影響,并初步探討了其相關(guān)的機(jī)制,為糖尿病血管病變的防治提供新的理論依據(jù)和治療藥物。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

        人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922EA.hy926 購于美國ATCC 細(xì)胞庫;DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco 公司);D-(+)-葡萄糖溶液(美國Sigma 公司);UA、Dorsomorphin(Compound C,Com C)dihydrochloride(美國Abmole 公司);CCK8 檢測試劑盒(索萊寶生物科技公司);人細(xì)胞上清內(nèi)皮素(endothelin-1,ET-1)酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司);一氧化氮檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒及二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)熒光探針(上海碧云天生物科技公司);細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)抗體、AMPK抗體、p-eNOS(Ser1177)抗體及p-AMPK(Thr172)抗體(Affinity 公司);GAPDH(武漢三鷹公司)。

        1.2 方 法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 內(nèi)皮細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基于37℃,5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合生長達(dá)到約90%,用0.25%胰酶消化按1∶2傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞接種24 h 后換液,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 為探討不同濃度UA 對高糖下內(nèi)皮細(xì)胞存活的影響,UA 干預(yù)做濃度梯度分別為(0.1、1、10、50 μmol)。實(shí)驗(yàn)分組處理如下:(1)正常對照組(normal glucose,NG:含5.5 mmol 葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基);(2)高糖對照組(high glucose,HG:含33 mmol 葡萄糖的高糖培養(yǎng)基);(3)高糖+UA 組(HG+UA:高糖培養(yǎng)基+UA 10 μmol 孵育);(4)高糖+UA+Compound C 組(HG+UA+Com C:高糖培養(yǎng)基+UA 10 μmol+Com C 1 μmol 孵育);干預(yù)時間為24 h。

        1.2.3 CCK8 檢測細(xì)胞存活 96 孔板貼壁細(xì)胞干預(yù)完后,向每孔加入10 μL CCK8 溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1~4 h,用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算并評價細(xì)胞相對存活。

        1.2.4 細(xì)胞上清一氧化氮濃度檢測 待細(xì)胞處理結(jié)束,培養(yǎng)基1 000g離心10 min取上清備用。96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,與NADPH(2 mmol)、FAD和Nitrate Reductase 混勻后,37 ℃孵育30 min;加入乳酸脫氫酶緩沖液和乳酸脫氫酶混勻后,37 ℃孵育30 min;加入Griess Reagent I 和Griess ReagentⅡ混勻后,室溫(20 ℃~30 ℃)孵育10 min 后立即用酶標(biāo)儀在540 nm 波長處測定各孔的光密度值并分析數(shù)據(jù)。

        1.2.5 細(xì)胞上清內(nèi)皮素-1濃度檢測 ET-1濃度采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測,樣品制備同1.2.4。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別加入反應(yīng)孔中,與親和鏈酶素-HRP 混勻后在37℃溫育60 min;洗板5 次;加入底物A、B 后37℃避光溫育15 min;加入終止液后立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光度并分析數(shù)據(jù)。

        1.2.6 二氫乙錠染色檢測活性氧簇生成 細(xì)胞干預(yù)完后,以5 μmol 的DHE 染色液37 ℃避光孵育30 min,磷酸鹽緩沖液溶液洗滌,經(jīng)熒光顯微鏡觀察并拍照。

        1.2.7 超氧化物歧化酶活性檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按照試劑盒說明書推薦的操作步驟收集細(xì)胞,氮藍(lán)四唑(NBT)顯色法測定SOD 活性(U/mL),37 ℃孵育30 min 后用酶標(biāo)儀在波長560 nm 處測定各孔吸光度值并計(jì)算SOD 相對活性。

        1.2.8 蛋白免疫印跡 細(xì)胞加入裂解液,提取總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度。將30 μg 變性好的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠,利用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,封閉1 h后,一抗4℃孵育過夜,TBST 洗膜3 次,二抗室溫孵育1 h,TBST 緩沖液洗膜3 次,掃膜成像。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計(jì)分析,GraphPad Prism 6.0 軟件制圖。計(jì)量資料用()表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 尿石素A 明顯提高高糖誘導(dǎo)條件下內(nèi)皮細(xì)胞存活

        CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高糖明顯降低了細(xì)胞存活(P<0.05),UA(1 μmol~10 μmol)呈劑量依賴性提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活。10 μmol 和50 μmol 無明顯差異(P>0.05)(圖1),后續(xù)實(shí)驗(yàn)UA 干預(yù)濃度取10 μmol。

        圖1 不同干預(yù)分組下內(nèi)皮細(xì)胞存活比較(HG:高糖培養(yǎng)基處理;UA:處理高糖組與正常組相比,aP<0.05;UA 處理組與高糖組相比,bP<0.05,ns:P>0.05)

        2.2 尿石素A 改善高糖環(huán)境所致血管內(nèi)皮功能障礙

        通過檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO 和ET-1 的分泌量,我們評估了UA 對高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮功能的影響。與正常對照組比較,高糖明顯降低NO 的分泌量(P<0.05),提高ET-1 的分泌量(P<0.05);加入UA(10 μmol)后,NO 的分泌量明顯升高(P<0.05),ET-1 的分泌量降低(P<0.05)。而UA 的調(diào)節(jié)作用在同時給予AMPK 的抑制劑后消失(圖2)。

        2.3 尿石素A 降低高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平

        從DHE 熒光染色[檢測活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成]結(jié)果及熒光定量分析和SOD活性結(jié)果來看,與正常對照組比較,高糖環(huán)境使血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 水平顯著升高,SOD 活性降低(P<0.05);UA孵育明顯減少ROS的水平和增加SOD活性(P<0.05);上述作用在同時給予AMPK 的抑制劑Com C后明顯減弱(P<0.05)(圖3)。

        圖2 UA對內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET-1的影響(A:內(nèi)皮細(xì)胞上清NO 濃度,B:內(nèi)皮細(xì)胞上清ET-1 濃度)注:HG 組與NG 組相比,aP<0.05;HG+UA 組與HG 組相比,bP<0.05;HG+UA+Com C 組與HG+UA 組相比,cP<0.05

        2.4 尿石素A 激活A(yù)MPK/eNOS 通路改善高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷

        在進(jìn)一步的機(jī)制探討中,我們通過蛋白免疫印跡檢測UA 對AMPK/eNOS 信號通路的影響,相應(yīng)蛋白磷酸化水平由p-AMPK/AMPK、p-eNOS/eNOS體現(xiàn)。結(jié)果顯示與正常組比較,高糖干預(yù)的內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK、eNOS 磷酸化水平明顯降低(P<0.05);UA 則可以有效逆轉(zhuǎn)AMPK、eNOS 磷酸化水平改變(P<0.05);但該作用可被AMPK 的抑制劑所拮抗(P<0.05),見圖4。以上結(jié)果表明,UA 可能通過激活A(yù)MPK/eNOS 通路改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

        3 討論

        近年來,我國糖尿病發(fā)病率逐年上升,糖尿病誘發(fā)的血管病變嚴(yán)重危害著糖尿病患者后期的生存質(zhì)量。糖尿病的發(fā)生伴有糖脂代謝紊亂,而血糖的增高和游離脂肪酸的增多均可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖損傷至關(guān)重要。

        圖3 各組內(nèi)皮細(xì)胞ROS 水平及SOD 活性比較(A:DHE 熒光染色,×400;B:相對熒光強(qiáng)度定量;C:SOD 相對活性)注:HG 組與NG組相比,aP<0.05;HG+UA 組與HG 組相比,bP<0.05;HG+UA+Com C 組與HG+UA 組相比,cP<0.05

        高糖環(huán)境下,內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位震蕩,NADPH 氧化酶活性增高,生成大量的ROS,破壞線粒體,使其功能嚴(yán)重失調(diào),加劇氧化應(yīng)激狀態(tài)。血管內(nèi)皮細(xì)胞能分泌多種活性物質(zhì)來發(fā)揮舒縮血管、調(diào)節(jié)血管通透性、抗凝抗血栓等重要功能[14-15],其中NO 具有舒張血管、抗血小板聚集的作用;ET-1具有收縮血管,促血小板黏附的作用,是內(nèi)皮依賴性血管舒縮作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。生理情況下,NO 與ET-1 處于動態(tài)平衡水平,維持血管張力。在高糖環(huán)境下,其平衡被打破,ET-1 可以通過激活ETA/ETB 受體,增加內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基的生成[16],內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷,引發(fā)血管病變。

        AMPK 在許多信號通路的占核心地位[17-18],在內(nèi)皮細(xì)胞中,AMPK/eNOS通路的激活,通過Ser1177位點(diǎn)激活eNOS 磷酸化,增加NO 的釋放量,提高內(nèi)皮細(xì)胞功能[19-20],還通過拮抗ET-1 濃度升高導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,發(fā)揮保護(hù)作用。此外,已經(jīng)研發(fā)用于治療2 型糖尿病的藥品,如二甲雙胍[21],噻唑烷二酮(TZD)[22]和胰高血糖素樣肽-1 受體激動劑[23],均能激活A(yù)MPK,證明可用于預(yù)防糖耐量降低,延緩2 型糖尿病的進(jìn)展。

        UA 是經(jīng)腸道菌群代謝生成的一類具有不同酚輕基的二苯并喃-6-酮衍生物,具有較高的生物利用度,對于多種疾病模型發(fā)揮積極的生物功效。Ryu 等[24]報(bào)道,UA 通過誘導(dǎo)線粒體自噬改善線粒體蛋白穩(wěn)態(tài),口服UA 可以延長線蟲壽命和改善小鼠骨骼肌功能。石榴汁可改善患有冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊邞?yīng)激誘導(dǎo)的心肌缺血[25]并抑制巨噬細(xì)胞膽固醇和氧化脂質(zhì)的積聚,減緩動脈粥樣硬化進(jìn)展以及控制其隨后的心血管事件的發(fā)生[26]。最新研究證實(shí),UA 可以直接清除自由基,保護(hù)Neuro-2a(神經(jīng)-2a)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮氧化酶抑制劑的效果,清除氧自由基,明顯改善抗氧化酶(SOD、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶等)的活性[22],提示UA在對抗氧化應(yīng)激方面有非常大的潛在價值。UA可以通過激活A(yù)MPK信號蛋白,促進(jìn)髓核(NP)細(xì)胞線粒體自噬,抑制凋亡,減弱椎間盤退行性變[27];在阿爾茲海默病模型中,通過增強(qiáng)腦神經(jīng)元AMPK激活,產(chǎn)生抗炎和神經(jīng)元保護(hù)作用,改善認(rèn)知能力[13]。

        以上研究表明,UA 具有抗氧化應(yīng)激的活性,且其發(fā)揮生物功效與AMPK 的激活相關(guān)聯(lián),但其在糖尿病血管病變中的作用,以及其作用是否與AMPK的激活有關(guān),國內(nèi)外目前無相關(guān)的報(bào)道。

        本研究證實(shí),UA 可顯著減輕高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 水平的升高,促進(jìn)eNOS 的磷酸化,通過維持NO/ET-1 的平衡而對血管舒縮、血小板聚集等生理活動具有調(diào)節(jié)作用,對抗高糖致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷;上述UA 的所有保護(hù)作用幾乎都被AMPK 的抑制劑Com C 所消除,提示UA 的保護(hù)作用可能通過激活A(yù)MPK/eNOS 通路,上調(diào)其磷酸化有關(guān)。

        綜上所述,UA 能夠抑制高糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激,改善血管內(nèi)皮功能障礙,顯著拮抗高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷,有望成為糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供新的干預(yù)手段,亦可為日后的相關(guān)研究提供思路。

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