薄雅坤，駱小梅，王貴鵬

（新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，烏魯木齊 830011）

心房顫動是最常見的持續(xù)性心律失常，常常會導(dǎo)致患者發(fā)生腦卒中。為減少心房顫動患者血栓栓塞和腦卒中的發(fā)生，一般口服法華林或達(dá)比加群酯等抗凝劑。達(dá)比加群酯作為新型口服抗凝劑，可有效抑制關(guān)鍵凝血因子，阻礙血栓形成，預(yù)防心房顫動患者腦卒中發(fā)生。然而，達(dá)比加群酯在降低腦卒中風(fēng)險的同時，也會增加出血風(fēng)險。P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白（adenosine triphosphate-binding cassette transporter，ABC）中最大的一個亞系，可以影響多種藥物的吸收和代謝［1-2］。而達(dá)比加群酯作為P-gp 的底物，其代謝水平很可能受到P-gp 表達(dá)和活性的影響。P-gp的編碼基因是ABCB1，ABCB1多態(tài)性（尤其是C3435T）可以影響P-gp 的表達(dá)和活性［3］。本文主要研究了新疆維吾爾族（維族）心房顫動患者ABCB1 基因C3435T 多態(tài)性與達(dá)比加群酯治療效果（包括血藥濃度、治療4 d 后凝血指標(biāo)以及致出血風(fēng)險）的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2016 年12 月在新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院住院或門診就診的心房顫動患者166例作為研究對象，其中漢族患者93例（男47例、女46例），維族患者73例（男37例、女36例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲、CHADS2 評分（表1）≥2 分的非瓣膜性心房顫動患者。非瓣膜性心房顫動診斷標(biāo)準(zhǔn)：2014 美國心臟協(xié)會（AHA）/美國心臟病學(xué)會（ACC）/美國心律學(xué)會（HRS）心房顫動指南定義為在不合并風(fēng)濕性二尖瓣病變、機(jī)械或生物瓣膜置換術(shù)以及二尖瓣成形術(shù)的情況下而出現(xiàn)的心房顫動。記錄患者年齡、身高、性別、體質(zhì)量指數(shù)、體質(zhì)量、出血事件及原發(fā)性高血壓（高血壓）、糖尿病、心力衰竭、腦卒中或短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）史和CHADS2 評分等一般資料。遵循隨機(jī)數(shù)字表法入選的患者隨機(jī)分為維族心房顫動組和漢族心房顫動組。研究對象在試驗前均簽署知情同意書。

1.2 ABCB1 基因多態(tài)性檢測方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集及基因組DNA 提取 采集患者外周血5 mL 于0.01%乙二胺四乙酸抗凝試管中，-80 ℃凍存，用于DNA 提取。DNA 提取采用PAX gene Blood DNA 提取試劑盒（天根），經(jīng)分光光度儀檢測其濃度、純度，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 質(zhì)量及完整性的質(zhì)檢。

1.2.2 基因型檢測 在UCSC、HapMap 數(shù)據(jù)庫中選擇出ABCB1 基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（sin?gle nucleotide polymorphism，SNPs）（C3435T 位點），利用Primer Premier 5.0 設(shè)計跨ABCB1_C3435T 位點的引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。引物序列合成由北京擎科生物科技有限公司完成。

PCR反應(yīng)體系50 μL：Ex Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL，dNTPs Mix 4 μL，模板DNA 2 μL，上游引物ABCB1-cx-439F和下游引物ABCB1-cx-439F（10 pmol·μL-1）各2 μL，滅菌超純水34.5 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min（表2），35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段切膠回收后送北京擎科生物科技有限公司測序。

根據(jù)測序獲得的序列，找到其中的SNPs 位點，設(shè)計兩對特異引物靶向不同的位點，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系50 μL：Ex Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL，dNTPs Mix 4 μL，模板DNA 2 μL，兩對特異引物（400F-T、400F-T 和250F-C、250R-C）（10 pmol·μL-1）各2 μL，滅菌超純水30.5 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s（表2），35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 ABCB1 基因引物信息

1.3 達(dá)比加群酯血藥濃度檢測

于患者服藥3 d 后抽取外周抗凝血1 mL，用液相色譜儀檢測。用甲醇沉淀血漿蛋白，采用Kro-masil C18 柱（100 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.01 mmol·L-1甲酸銨溶液-甲醇（77∶23），流速為0.5 mL·min-1。測晨起服藥后2 h 和12 h（晚間服藥前）的血藥濃度作為峰濃度和谷濃度。

1.4 凝血指標(biāo)檢測

在Sysmex CS5100 上檢測維族心房顫動患者服用達(dá)比加群酯前和服用4 d 后的凝血指標(biāo)，包括活化部分凝血酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（International normalized ratio，INR）并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.5 一般指標(biāo)觀察

所有入選患者均經(jīng)知情同意后開始口服達(dá)比加群酯110 mg，一天2 次治療，在服藥前、服藥后4 周、12 周分別進(jìn)行凝血功能、血常規(guī)及肝、腎功能檢測，并觀察患者服藥后1 年內(nèi)發(fā)生全身栓塞及出血事件的情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以［n（%）］表示，采用χ2檢驗。計量資料以（）表示，兩組間采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢族和維族患者基線資料比較

漢族與維族兩組患者年齡、身高、性別、體質(zhì)量指數(shù)、體質(zhì)量、出血事件及高血壓、糖尿病、心力衰竭、腦卒中或TIA 史和CHADS2 評分等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3 和表4。

表3 漢族和維族患者計量臨床資料比較 ［］

表3 漢族和維族患者計量臨床資料比較 ［］

表4 漢族和維族患者計數(shù)臨床資料比較 ［n（%）］

2.2 ABCB1 基因型鑒定結(jié)果

使用跨ABCB1_C3435T位點的引物對患者基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物回收后進(jìn)行測序。對患者基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增用以檢測ABCB1 基因C3435T 位點。瓊脂糖凝膠電泳顯示：CT 型雜合子含有一條約250 bp 的條帶和一條約400 bp 的條帶；CC 型純合子含有一條約250 bp 的條帶；TT 型純合子含有一條約400 bp 的條帶。測序結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果吻合（圖1）。

2.3 漢族和維族患者基因型及等位基因頻率分布比較

漢族患者共93 例，其中C3435T 位點CC、CT、TT 基因型分別為29 例（31.2%）、46 例（49.5%）、18例（19.3%）；C和T 等位基因分別為104例（55.9%）、82 例（44.1%）；維族患者共73 例，其中C3435T 位點CC、CT、TT 基因型分別為23 例（31.5%）、36 例（49.3%）、14 例（19.2%）；C 和T 等位基因分別為82 例（56.2%）、64 例（43.8%）。維族和漢族兩組患者中的CC、CT、TT 基因型頻率及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

圖1 ABCB1 基因型C3435T 基因型鑒定圖

表5 漢族和維族患者基因型及等位基因頻率分布比較

2.4 達(dá)比加群酯血藥濃度與基因型的關(guān)系

將心房顫動患者按照C3435T 位點基因型分為CC 型組，TT 型組和CT 型組，分析比較不同基因型的維族心房顫動患者經(jīng)相同劑量的達(dá)比加群酯治療期間血藥濃度的差異，結(jié)果表明，TT 型組患者的血藥峰濃度最高，CT 型組次之，CC 型組最低，方差分析表明三者總體差異具有極顯著性（P＜0.001），見表4。任意兩組患者的血藥峰濃度比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。TT 型組患者的血藥谷濃度最高，CT 型組次之，CC型組最低，方差分析表明三者總體差異具有極顯著性（P＜0.001），見表4。任意兩組患者的血藥谷濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。

表6 不同基因型患者達(dá)比加群酯治療后血藥濃度比較［mg·L-1，］

表6 不同基因型患者達(dá)比加群酯治療后血藥濃度比較［mg·L-1，］

2.5 達(dá)比加群酯治療前后凝血指標(biāo)的比較

維族心房顫動患者服用達(dá)比加群酯后4 d 的凝血指標(biāo)APTT［（35.11±5.10）svs.（29.94±1.58）s，P＜0.01］、TT［（80.28±44.44）svs.（18.82±1.50）s，P＜0.01］、PT［（12.55±1.03）svs.（11.21±0.96）s，P＜0.01］、INR（1.39±0.17vs.1.13±0.14，P＜0.01）比服用前顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

圖2 不同基因型患者達(dá)比加群酯治療后血藥濃度比較（圖A 為峰濃度，圖B 為谷濃度）

圖3 達(dá)比加群酯治療前后凝血指標(biāo)比較（注：與治療前比較，**P＜0.05）

2.6 不同基因型患者治療前后凝血指標(biāo)比較

不同基因型患者服用達(dá)比加群酯前APTT、TT、PT、INR 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.01），服用達(dá)比加群酯后APTT、TT、PT、INR 均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中APTT 和APTT變化率在TT 型組中顯著高于CT 型組和CC 型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；TT 和TT 變化率在TT 型組中顯著高于CC 型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而PT 和PT 變化率、INR 和INR 變化率在不同基因型患者中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表7。

2.7 達(dá)比加群酯治療后出血事件與基因型的關(guān)系

分析比較ABCB1 不同基因型的維族心房顫動患者在達(dá)比加群酯治療期間的出血事件發(fā)生率，結(jié)果表明，CC、CT、TT 基因型的心房顫動患者在達(dá)比加群酯治療期間的出血事件發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［8.7%（2/23）vs.5.6%（2/36）vs.14.3%（2/14），P＞0.05］。

3 討論

已有研究報道指出，在不同地區(qū)、不同民族ABCB1 基因C3435T 的分布頻率有所不同［4］。本研究通過檢測ABCB1 基因C3435T 多態(tài)性，比較了新疆地區(qū)漢族和維族心房顫動患者之間的差異，結(jié)果顯示，漢族和維族心房顫動患者C3435T 多態(tài)性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)中中國人在該位點的頻率分布相符［4-5］。

表7 不同基因型患者治療前后凝血指標(biāo)比較

ABCB1 基因C3435T 已被報道能夠影響多種藥物的血藥濃度，如華法林、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、他克莫司和利培酮等［7-10］。本研究比較了ABCB1基因C3435T 不同基因型維族心房顫動患者達(dá)比加群酯治療后血藥濃度，結(jié)果顯示，3 種基因型患者的血藥峰濃度和血藥谷濃度均有顯著差異，TT型最高，CC 型最低。ABCB1 基因編碼P-gp，C3435T多態(tài)性雖然不改變P-gp 的氨基酸序列，但是能夠改變P-gp 的表達(dá)和活性［11-12］。本研究中ABCB1基因C3435T 很可能是通過影響P-gp 的表達(dá)和（或）活性影響了達(dá)比加群酯的代謝，進(jìn)而影響了患者體內(nèi)達(dá)比加群酯的血藥濃度。

本研究比較了ABCB1 基因C3435T 不同基因型維族心房顫動患者達(dá)比加群酯治療后凝血指標(biāo)，結(jié)果顯示，3 種基因型患者的APTT 存在顯著差異；CC 型患者和TT 型患者的TT 存在顯著差異；3 種基因型患者的PT、INR 差異不明顯。有研究報道，達(dá)比加群酯血藥濃度與APTT 和TT 存在線性正相關(guān)，而與PT 不相關(guān)［13］。表明TT 型患者的APTT 和TT 顯著高于CC 型患者可能是因為TT 型患者達(dá)比加群酯血藥濃度顯著高于CC 型患者。

出血事件是抗凝治療的不良反應(yīng)之一。本研究比較了ABCB1 基因C3435T 不同基因型維族心房顫動患者達(dá)比加群酯治療后出血事件，結(jié)果顯示，3 種基因型患者中出血事件發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明ABCB1 基因C3435T對維族心房顫動患者達(dá)比加群酯治療后是否發(fā)生出血事件沒有影響。

圖3 不同基因型患者達(dá)比加群酯治療前后凝血指標(biāo)比較柱狀圖（注：與治療后比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與TT 型組比較，1）*P＜0.05，1）**P＜0.01