劉欣欣，李 赫，卜慶云，田曉杰，王臻昱，何明良，唐佳琦，李秀峰，孟 威

(1.東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150060；2.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；3.東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

0 引 言

水稻是我國的主要糧食作物之一，近年來受耕地面積的減少以及各種生物脅迫的影響，水稻的產(chǎn)量已下降[1]。為了提高水稻產(chǎn)量和水稻的品質(zhì)，經(jīng)過國內(nèi)外專家的不懈努力，水稻育種已經(jīng)由傳統(tǒng)育種進入到借助分子生物學、分子遺傳學以及經(jīng)典遺傳學等理論，運用分子標記技術輔助育種[2]、生物信息學[3]、轉(zhuǎn)基因育種技術[4]、分子設計學育種[5]等方法進行的分子育種的階段。由于現(xiàn)代水稻分子育種具有更廣泛的實用性，以及育種周期短、效率高等優(yōu)點，已經(jīng)成為水稻育種的主要發(fā)展方向。

任何新的育種技術的研發(fā)和應用都會帶來新的改變，基因編輯技術就是典型的代表[6]。基因組編輯技術[7]是利用工程核酸酶誘導基因組產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，進而激活細胞內(nèi)源修復機制，實現(xiàn)對基因組的精確的修飾(替換、插入或缺失)。

高效的基因編輯技術是研究細胞過程和生物分子機制的重要工具，基因編輯技術在育種上的應用十分廣泛[8]。在現(xiàn)代基因編輯技術的發(fā)展過程中，分別出現(xiàn)了鋅指核酸酶系統(tǒng)(ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶系統(tǒng)(TALENs)和規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列系統(tǒng)(CRISPR)[9]。三種基因編輯系統(tǒng)具有不同的編輯原理，且不同編輯系統(tǒng)作用的方式也不相同，但都依賴于經(jīng)過人工改造的限制性內(nèi)切酶[10]。ZFN和二代基因編輯技術TALENs作為最初的基因編輯技術，二者都是由DNA結(jié)合蛋白和核酸內(nèi)切酶FokⅠ融合而成[11-12]，能夠精確識別并特異性切割DNA序列，使DNA雙鏈發(fā)生斷裂，最后通過同源重組或非同源末端連接的方法實現(xiàn)基因組堿基的刪除、插入或突變[13]。但ZFN技術的運用有明顯的局限性，載體構(gòu)建難度大，對目標序列也有嚴格的要求，所以設計出適合的打靶位點十分困難，即使設計出合適的打靶位點，若沒有高親和性、高特異性的鋅指蛋白與打靶位點結(jié)合，也十分易出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，使DNA發(fā)生錯配和序列的改變，不僅工作量大，費用還高[14]；TALENs技術雖然對打靶位點設計要求低，選擇多，但其載體構(gòu)建繁瑣，難度大。所以需要一種簡單、高效、穩(wěn)定且成本低的基因組編輯技術來改變現(xiàn)狀。與前兩種技術相比，CRISPR/Cas9技術操作更簡單、成本更低、效率更高，不需要設計和構(gòu)建蛋白，只需要設計sgRNA，就會產(chǎn)生突變并識別不同的打靶位點進而實現(xiàn)基因編輯[15]，實驗已經(jīng)證明了CRISPR/Cas9精確編輯技術在水稻中具有可行性[16-17]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻進行基因定點突變，通過有效控制水稻基因組的修飾，進而將具有優(yōu)良性狀的基因整合到一起，使CRISPR/Cas9技術成為保證稻米品質(zhì)，提高水稻抗逆性及產(chǎn)量的重要手段。本文總結(jié)了近幾年CRISPR/Cas9基因編輯技術在水稻新品種培育方面的應用，詳細闡述了參與水稻抗逆性調(diào)控基因的編輯、品質(zhì)及熟期等農(nóng)藝性狀相關基因的編輯，旨在為未來提高水稻抗逆性，獲得早熟品質(zhì)水稻品種提供有力的理論指導。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術簡介

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)由CRISPR基因座和Cas基因2部分組成(圖1)，CRISPR基因座由富含AT結(jié)構(gòu)的300～500 bp的前導序列，其可作為啟動子啟動CRISPR序列調(diào)控轉(zhuǎn)錄出pre-crRNA和tracrRNA，包括可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的回文序列的重復序列 (Repeat) 和被細菌俘獲的外源DNA序列(間隔序列)。分別以重復序列開始和結(jié)束，每2個重復序列之間穿入一個間隔序列，因此，重復序列的數(shù)量始終比間隔序列數(shù)量多1個。Folk酶功能與Cas蛋白十分相似，通過特異性位點識別切斷入侵DNA片段，進而降解外來基因序列。目前已發(fā)現(xiàn)Cas1-Cas12等多個Cas蛋白[18-20]。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖[21]Fig.1 Diagram of CRISPR/Cas system structure

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)類型及CRISPR/Cas9原理

CRISPR系統(tǒng)3種類型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ[22]，3種類型都包括目標DNA、靶向crRNA和PAM序列，其中Ⅰ型CRISPR和Ⅲ型CRISPR均需要多種Cas蛋白和crRNA協(xié)同作用才能夠剪切外源DNA，而II型CRISPR僅僅需要Cas9、crRNA、tracrRNA互相協(xié)作就可以發(fā)揮作用，降解外源DNA[23]，操作上具有實用性。

CRISPR/Cas9隸屬于Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)。其原理是反式激活crRNA和CRISPR RNA結(jié)合成雙元聚合體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被稱為單一引導RNA，引導內(nèi)切酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。Cas9蛋白是一個具有RuvC核酸酶活性結(jié)構(gòu)域及HNH的功能蛋白，通過識別外源DNA序列中3至6個堿基組成的具有原間隔序列的PAM (Proto-spacer adjacent motif)，對外源雙鏈DNA序列進行切割，并引起外源DNA序列的雙鏈發(fā)生斷裂(DSB)[24]，隨后，在其修復的過程中可以實現(xiàn)對基因組的特定位點進行DNA的缺失、插入、堿基突變以及修飾作用。

1.3 CRISPR/Cas9的編輯形式

CRISPR/Cas9的編輯形式有兩種，即基因敲除形式和基因的插入或替換形式。

基因敲除是在目的基因的上下游分別設計一個引導RNA，將Cas9蛋白編碼基因連接到質(zhì)粒上，將連接好的質(zhì)粒導入受體細胞，引導gRNA通過堿基互補配對原則靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白編碼基因使該基因上下游的DNA雙鏈發(fā)生斷裂，但是由于生物體存在DNA損傷修復應答機制來保護自身免受外界不良環(huán)境的侵害，生物體會將斷裂的上下游兩端的基因序列重新連接起來，從而成功敲除目標基因。

基因的插入或替換，是在基因敲除技術的基礎上，引入一個能自我修復的模板，細胞就按照符合預期的模板，在細胞修復過程中通過在特定位點突變或引入、插入突變片段，實現(xiàn)對基因的突變。其中包括兩種突變形式，一種是單堿基編輯形式。單堿基編輯技術是指對目標基因片段中的特定位點的單個堿基進行替換。其工作原理是在雙鏈不發(fā)生斷裂的情況下，分別利用胞嘧啶脫氨酶(APOBEC)或經(jīng)改造的腺嘌呤脫氨酶對靶點上一定范圍內(nèi)的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)進行脫氨基反應，經(jīng)過DNA修復作用，最終實現(xiàn)A-G或C-T堿基對的精準替換。另一種是直接調(diào)控基因的表達，在CRISPR/Cas的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9的切割域突變，會使Cas9蛋白失去對DNA的切割活性，但不影響其與DNA的結(jié)合力[25-26]，這種蛋白被命名為dCas9蛋白。若dCas9蛋白能與特定的靶向基因引導RNA(gRNA)在細胞中共同表達，則gRNA介導的dCas9蛋白就會與DNA結(jié)合。若dCas9蛋白結(jié)合到靶基因編碼區(qū)之內(nèi)，就可以阻斷RNA聚合酶的延伸作用；若結(jié)合到啟動子區(qū)域則會阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始過程。

2 CRISPR/Cas9在水稻中的應用

2.1 抗病水稻品種選育

稻瘟病是由稻瘟病菌產(chǎn)生的分生孢子侵染水稻，從而引起最具危害性的真菌病害[27]。稻瘟病可以發(fā)生在水稻生長中任何一個生育期。傳統(tǒng)水稻抗病育種方法一般是常規(guī)育種，誘變育種和雜交育種是兩個典型的代表[28]，以人工選擇結(jié)合抗性鑒定為輔助，將抗稻瘟病品種中所攜帶的抗病基因?qū)肽繕酥仓?，獲得新的抗稻瘟病品種，此外對抗病基因分子標記的開發(fā)同樣用于抗病育種輔助選擇[29]。隨著轉(zhuǎn)基因技術的誕生，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術創(chuàng)建水稻突變體，也為培育抗稻瘟病新品種帶來了新的機遇[30]。Xu等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，以Pita、Pi21和ERF922為靶基因，構(gòu)建共編輯載體，轉(zhuǎn)化長粒粳稻恢復系，T0代轉(zhuǎn)基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突變頻率分別為75%、85%和65%，突變類型多為雙等位突變。篩選出無轉(zhuǎn)基因標記的T1代能夠穩(wěn)定遺傳給T2代，最終獲得Pi21單突變純合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突變純合株系。稻瘟病抗性鑒定結(jié)果表明，與野生型相比，突變株系的抗性顯著提高。Li等[32]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9編輯技術定向改造水稻性狀，抑制了bsr-d1基因在水稻中的表達，使水稻植株表現(xiàn)出顯著的抗稻瘟病特性，經(jīng)過水稻抗病性試驗結(jié)果證實，bsr-d1是水稻稻瘟病的一個廣譜抗病性基因。

2.2 抗除草劑水稻品種選育

雜草是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素，噴除草劑是目前經(jīng)濟有效的方法，但是除草劑在殺死雜草的同時也抑制了水稻的生長[33]，影響水稻生長發(fā)育的速度以及水稻的產(chǎn)量，所以培育抗除草劑水稻品種對提高水稻的抗逆性十分重要。目前比較快速、精準的育種方法是利用CRISPR/Cas9技術定點突變除草劑相關調(diào)控基因，獲得發(fā)生等位變異的除草劑抗性基因進而創(chuàng)制具有除草劑抗性的水稻品種。Li等[34]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9技術定點替換、插入水稻內(nèi)源性EPSPS基因，得到了含有抗草甘膦基因的水稻材料；Sun等[35]采用CRISPR/Cas9技術，以堿基插入與替換的方式定向改造水稻基因組序列，在同一載體上將Cas9蛋白、2個gRNA和用于同源修復的模板構(gòu)建到其中，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，得到含有不連續(xù)點突變ALS基因的抗除草劑水稻品種。

2.3 高品質(zhì)水稻品種培育

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術可以提高稻米的品質(zhì)。Li等[36]利用CRISPR/Cas9技術，編輯出新的Wx的等位基因。首先設計出sgRNA，啟動Wxmq包含區(qū)域，在PAM的NGG位點附近有許多鳥嘌呤堿基(G)，因此使用胞嘧啶堿基編輯器進行編輯，這種編輯器在水稻中具有較高的編輯效率，通過編輯接近目標產(chǎn)物的氨基酸，進而控制稻米的AC含量，生產(chǎn)粘度低的糯米且不影響水稻的產(chǎn)量。周文甲等[37]利用CRISPR/Cas9技術對水稻品種綏粳14的香味基因Badh2和抽穗基因Hd2進行編輯，結(jié)果表明突變體株型比綏粳14約早成熟13天，并且香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉 (2-AP)的含量也顯著高于野生型綏粳14，進而成功獲得早熟且有香味的稻米[38]。邵高能等[39]利用CRISPR/Cas9技術對水稻品種中花11的香味基因Badh2進行編輯，對獲得的轉(zhuǎn)基因后代測定其香味物質(zhì)2-AP的含量，野生型2-AP含量為0.07 mg·kg-1，而突變體中2-AP含量為1.2 mg·kg-1。范美英等[40]構(gòu)建靶向水稻直鏈淀粉合成主效基因Wx的CRISPR/Cas9表達載體，通過農(nóng)桿菌134進行遺傳轉(zhuǎn)化，對獲得的轉(zhuǎn)基因后代的直鏈淀粉含量進行測定，野生型的直鏈淀粉含量19.8%，3個突變體的直鏈淀粉含量為1.64%、2.14%與1.67%。

2.4 高產(chǎn)水稻品種培育

多個因素共同決定水稻的高產(chǎn)性狀，有效穗數(shù)、穗粒數(shù)以及千粒重是決定水稻單株產(chǎn)量的主要因素[41-42]。水稻的穗數(shù)與水稻的分蘗能力密切相關，主要由一級和二級分蘗數(shù)共同決定。穗粒數(shù)由稻米結(jié)實率和每穗穎花數(shù)共同決定，每穗穎花數(shù)由一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)決定。千粒重受灌漿率和粒型兩個因素決定，水稻粒型又由粒寬、粒厚和粒長3個因素共同決定。Shen等[43]利用CRISPR/Cas9技術對4種不同的水稻品種進行基因編輯，研究發(fā)現(xiàn)與野生型相比，gs3和gs3gn1a突變體的粒長和千粒重均有所增加。Li等[44]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9技術，以中花11為試驗育種材料，對GS3、IPA1、Gn1a和DEP1這4個與產(chǎn)量性狀相關聯(lián)的基因進行定向編輯，發(fā)現(xiàn)帶有gn1a、gs3和dep1這3種基因的突變體植株的穗數(shù)、粒重和每穗粒數(shù)均增加。由于IPA1突變體基因編輯位點不同，植株表現(xiàn)出兩種表現(xiàn)型，分別為分蘗減少或分蘗增多。Li等[45]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9技術，以龍粳11為背景，選擇GS3，GS9和Badh2這3個基因為靶基因進行定向編輯，通過農(nóng)桿菌介導的方法獲得gs3gs9badh2三基因突變體，其后代與野生型龍粳11相比，粒長增加26.4%～27.0%，單株產(chǎn)量增加10.8%～12.1%，千粒重增加18.3%～41.4%。

2.5 早熟水稻品種選育

我國的黑龍江省具有供水稻種植的大面積土地[46]。但是由于水稻是熱帶短日照的植物，所以需要對水稻的品種進行改良來適應黑龍江省日照時間長和氣溫低等因素的影響，傳統(tǒng)的雜交育種對水稻品種的選育費時費力。Li等[47]利用CRISPR/Cas9技術，以水稻開花抑制因子Hd2、Hd4和Hd5為靶基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9Pubi-H載體，以不同品種為底盤獲得抽穗期提前的改良品種，較為快速且經(jīng)濟有效的實現(xiàn)了水稻新品種的開發(fā)，同時促進了南方優(yōu)質(zhì)水稻品種的引進，加快了黑龍江省的水稻育種進程。此外，Li等[48]通過對水稻的花期基因(抽穗基因)進行編輯，發(fā)現(xiàn)Hd2、Hd4和Hd5是主要的開花抑制因子，Dth2和Hd18是主要的開花促進因子，Hd6和Hd16是次要開花抑制因子，Hd17是次要的開花促進因子，只有當Hd2和Hd4同時起作用時，才能檢測到它們的有效性。進一步證實了開花時間是影響產(chǎn)量的主要因素，通過對花期基因的不同組合可以培養(yǎng)出高產(chǎn)的水稻品種。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術在水稻品種改良中得到了廣泛應用，針對不同性狀改良相關基因總結(jié)如表1，未來對基因功能的深入研究將極大的促進水稻分子育種的進程。

表1 水稻分子育種中應用的部分相關基因匯總Table 1 Summary of some related genes used in molecular breeding of rice

3 展 望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是基因編輯技術的重大發(fā)現(xiàn)，他可以在特定位點上切割DNA雙鏈，誘導細胞進行自主修復，如非同源末端連接(NHRJ)或同源重組(HDR)，從而實現(xiàn)有效的定點基因組編輯[37]。其構(gòu)建簡便、精度高、周期短、成本低，能夠高效地獲得具有遺傳穩(wěn)定性的材料，為研究基因功能提供材料保障和技術支持。但目前還存在諸多的問題如：脫靶率較高，基因編輯效率較低，堿基具有偏好性，不同基因編輯位點效率不同，限制了基因編輯技術的大規(guī)模應用。盡管如此，CRISPR/Cas9技術已經(jīng)在改良水稻性狀和水稻分子育種上發(fā)揮了作用。而且，我國科學家已經(jīng)提出了水稻“2020研究計劃”和“水稻4D基因組學研究計劃”[5]，相信CRISPR/Cas9技術將不斷運用到水稻功能基因組研究中，通過CRISPR/Cas9技術，使水稻的多個優(yōu)良基因融合表達成為可能，使水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)不斷提高。也可以利用CRISPR/Cas9技術選育抗逆性的水稻品種，使水稻植株具有抗鹽堿脅迫、冷脅迫和低溫脅迫的優(yōu)良性狀，為水稻在更廣范圍內(nèi)種植提供了可能性，對未來的水稻分子育種具有深遠的影響。