王 慧 劉 帥 梁云浩 馬才啟 陳 娟 尹敏娜

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 (廣州 510623)

近年來，囊胚移植(blastocyst transfer，BT)因其能通過延長胚胎培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步篩選出發(fā)育潛能更高的胚胎，而越來越多的被臨床應(yīng)用。研究已證實(shí)囊胚移植同卵裂期胚胎移植相比，可以提高臨床妊娠率及胚胎著床率，減低多胎率[1- 4]。因此目前，很多中心都采取將受精后第 3 天(D3)的胚胎繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)至第 5 天(D5)和第6 天(D6)的臨床策略。但究竟什么質(zhì)量的卵裂期胚胎有更好的囊胚發(fā)育潛能，還沒有定論。目前，我們評(píng)價(jià)D3卵裂期胚胎質(zhì)量的好壞主要依賴胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分，通過胚胎的生長速率、碎片多少及卵裂球均一性來評(píng)價(jià)。本研究的目的在于通過研究D3不同質(zhì)量的卵裂期胚胎發(fā)育為囊胚的潛能，旨在為囊胚培養(yǎng)的結(jié)果預(yù)測提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究回顧性分析2015年4月—2019年4月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行體外受精一胚胎移植(IVF—ET)治療的患者，胚胎納入標(biāo)準(zhǔn)為新鮮周期除去移植、冷凍剩余行囊胚培養(yǎng)的胚胎。經(jīng)患者知情同意后將剩余胚胎(共5 510枚)轉(zhuǎn)囊胚培養(yǎng)，繼續(xù)觀察并記錄囊胚形成情況，有囊胚形成時(shí)根據(jù)形成囊胚的質(zhì)量選擇移植、冷凍或拋棄。

1.2 促排卵治療方案及授精

所有患者使用本中心常規(guī)促排卵方案。陰道B超監(jiān)測到3個(gè)或以上直徑≥18 mm卵泡時(shí)，肌肉注射5 000 U～10 000 U HCG(雪蘭諾，瑞士)，36 h后在陰道B超監(jiān)測下采卵。

取卵日根據(jù)男方精子質(zhì)量決定IVF或ICSI受精方式。授精18～20 h觀察原核，受精胚胎放在胚胎培養(yǎng)液(G1，vitrolife,Sweden)液滴中，置于6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 D3卵裂期胚胎質(zhì)量評(píng)估及分組

授精后D3根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估胚胎質(zhì)量，記錄卵裂球數(shù)量，胚胎碎片率及卵裂球不對(duì)稱性等。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：優(yōu)質(zhì)胚胎定義為受精后第3天胚胎卵裂球數(shù)目為7或8個(gè)，卵裂球大小均勻，及碎片<15%；其余為非優(yōu)質(zhì)胚胎。挑選胚胎移植或冷凍，剩余胚胎均經(jīng)患者知情同意后轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(G2，vitrolife,Sweden)液滴中，置于6%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。

根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎質(zhì)量分為優(yōu)質(zhì)組(n=564)和非優(yōu)質(zhì)組(n=4 946)；根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎卵裂球數(shù)量分為<4細(xì)胞組(n=661)，4- 6細(xì)胞組(n=2 348)，7- 9細(xì)胞組(n=2 090)，>9細(xì)胞組(n=286)和融合期胚胎(Compact,CP)組(n=125)；根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎卵裂球均一性多分為卵裂球大小均勻組(-)(n=1 966)，卵裂球大小差異為(+)組(n=2 174)及卵裂球大小差異為(++/+++)組(n=1 370)；根據(jù)D3轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎碎片多少分為碎片≤10%組(n=2 939)，10%～25%組(n=1 574)及碎片>25%組(n=997)。

1.4 囊胚培養(yǎng)及觀察

授精后D5及D6觀察囊胚形成情況。囊胚評(píng)分采用Gardner評(píng)分方法[3]:根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度分為6 個(gè)時(shí)期。Ⅰ期：早期囊腔不超過囊胚總體積的1/2；Ⅱ期：囊腔體積超過囊胚總體積的1/2；Ⅲ 期：囊腔全占據(jù)整個(gè)囊胚；Ⅳ 期：囊腔繼續(xù)擴(kuò)張，透明帶變?。虎跗冢翰糠帜遗邚耐该鲙е蟹醭?；Ⅵ 期：囊胚完全孵出。處于Ⅲ～Ⅵ 期的囊胚根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級(jí)：A 級(jí)細(xì)胞排列緊密且數(shù)量多，B 級(jí)細(xì)胞排列松散且數(shù)量較少，C 級(jí)細(xì)胞數(shù)量很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分級(jí)：A 級(jí)上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)致密且有較多細(xì)胞，B 級(jí)上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)松散且細(xì)胞不多，C 級(jí)上皮細(xì)胞層由稀疏細(xì)胞組成。

采用 Gardner囊胚分級(jí)系統(tǒng)[5]，將 D5評(píng)分≥ⅢBB、D6評(píng)分≥ⅣBB 定為優(yōu)質(zhì)囊胚，將 D5評(píng)分>ⅢCC、D6評(píng)分>ⅣCC 定為可利用囊胚。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

囊胚形成率=形成的囊胚數(shù)/轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)；可利用囊胚形成率=可利用囊胚數(shù)/轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示。率的比較采用χ2檢驗(yàn)。描述各分析指標(biāo)與囊胚培養(yǎng)結(jié)局的關(guān)系用二分類Logistic回歸分析。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 D3胚胎質(zhì)量評(píng)估的各指標(biāo)與囊胚形成的關(guān)系

2.1.1 D3胚胎質(zhì)量與囊胚形成的關(guān)系：與優(yōu)胚組相比，D3非優(yōu)質(zhì)胚胎組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.1.2 D3胚胎卵裂球數(shù)目與囊胚形成的關(guān)系：與7- 9細(xì)胞組相比，融合期胚胎(CP)組和> 9細(xì)胞組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)；與7- 9細(xì)胞組相比，4- 6細(xì)胞組和<4細(xì)胞組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.1.3 D3胚胎卵裂球大小均一性與囊胚形成的關(guān)系 ：與卵裂球大小均勻(-)組相比，卵裂球大小差異為+組及卵裂球大小差異為++/+++組的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

2.1.4 D3胚胎卵裂球碎片率與囊胚形成的關(guān)系：與碎片<10%組相比，碎片為10%～25%組及碎片>25%組的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及可利用囊胚形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表1 D3胚胎質(zhì)量與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

表2 D3胚胎卵裂球數(shù)目與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

表3 D3胚胎卵裂球大小均一性與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

表4 D3胚胎卵裂球碎片率與囊胚形成的關(guān)系 n(%)

2.2 Logistic分析

將上述因素分析中的差異因素，即D3胚胎質(zhì)量、卵裂球數(shù)目、卵裂球均一性及碎片率做Logistic分析，用Forward LR方法，結(jié)果提示D3胚胎質(zhì)量、卵裂球數(shù)目、卵裂球均一性及碎片率均與可利用囊胚形成顯著相關(guān)(P<0.05)。隨著D3胚胎質(zhì)量的提高，卵裂球數(shù)目的增加，卵裂球均一性的提高，碎片率的減少，可利用囊胚形成也隨之提高。其中，D3胚胎質(zhì)量、卵裂球數(shù)目及均一性同可利用囊胚形成成正相關(guān)，碎片率同可利用囊胚形成成負(fù)相關(guān)。在這些因素中，D3胚胎質(zhì)量和卵裂球數(shù)目對(duì)可利用囊胚形成有較大影響(表5)。

表5可利用囊胚形成多因素Logistic回歸分析

3 討 論

以往的常規(guī)體外受精-胚胎移植( IVF-ET) 治療中，一般選擇受精后D3的卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎移植。近年來，隨著序貫培養(yǎng)體系的不斷完善，囊胚培養(yǎng)變得相對(duì)成熟。有研究表明，囊胚培養(yǎng)不僅有利于提高移植周期的臨床妊娠率和活產(chǎn)率[6- 7]，同時(shí)還可明顯降低多胎妊娠的發(fā)生率[8- 9]。目前對(duì)于很多中心而言，胚胎常規(guī)體外培養(yǎng)至D3時(shí)，是否行囊胚培養(yǎng)，仍然需要我們根據(jù)D3胚胎質(zhì)量和患者的具體情況作出選擇。但究竟什么質(zhì)量的卵裂期胚胎有更好的囊胚發(fā)育潛能，目前還沒有定論。本研究回顧性分析了近四年來本中心新鮮周期中除去D3移植、冷凍外剩余行囊胚培養(yǎng)的5 510枚胚胎，探討不同質(zhì)量卵裂期胚胎和囊胚形成的相關(guān)性，為囊胚形成的預(yù)測提供依據(jù)。

對(duì)于卵裂期胚胎質(zhì)量的評(píng)估，目前應(yīng)用最廣泛的依然是胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)。根據(jù)ESHERE 發(fā)布的2011 版Istanbul共識(shí)，在受精后(68±1)h觀察胚胎，綜合比較其卵裂球大小、數(shù)目、胞質(zhì)碎片等參數(shù)來評(píng)價(jià)。我們中心根據(jù)這些指標(biāo)綜合評(píng)估將D3胚胎分為優(yōu)質(zhì)胚胎和非優(yōu)質(zhì)胚胎。近來，雖然有觀點(diǎn)認(rèn)為單從D3胚胎的形態(tài)來預(yù)測胚胎發(fā)育潛能不夠精確[10]，但我們的研究結(jié)果仍然表明通過形態(tài)學(xué)評(píng)分選出的優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成各項(xiàng)指標(biāo)都要遠(yuǎn)高于非優(yōu)質(zhì)胚胎(P<0.05)。非優(yōu)質(zhì)胚胎組的可利用囊胚形成率只有21.39%，這提示我們可以將D3的非優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，以淘汰掉一些發(fā)育潛能差的胚胎，在D5或D6再將可利用囊胚進(jìn)行冷凍，這樣可以降低患者的冷凍費(fèi)用，為患者保存一些更有價(jià)值的胚胎。

我們的Logistic分析結(jié)果顯示D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分的指標(biāo)，包括卵裂球數(shù)目、均一性、胞質(zhì)碎片等都同可利用囊胚形成顯著相關(guān)(P<0.05)。相對(duì)而言，卵裂球數(shù)量比卵裂球均一情況及胚胎碎片含量更能預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能。生長速率是評(píng)估胚胎潛在活力的有力指標(biāo)。人類胚胎正常的發(fā)育速度是：受精后第1天為2細(xì)胞期，第2天為4- 6細(xì)胞期，第3天為7- 9細(xì)胞期。因此在 D3時(shí)，<7細(xì)胞胚胎發(fā)育較慢，>9細(xì)胞胚胎則發(fā)育較快。以往研究[11]表明，D3胚胎為7- 9細(xì)胞時(shí)，囊胚形成率最高，這說明卵裂速度過慢或過快都會(huì)對(duì)囊胚形成產(chǎn)生影響。但也有文獻(xiàn)報(bào)道[12]D3卵裂期胚胎卵裂球數(shù)>9個(gè)的更容易形成囊胚。我們的研究結(jié)果表明D3發(fā)育較快的胚胎(CP組和>9細(xì)胞組)和發(fā)育速度正常的胚胎(7- 9細(xì)胞)相比，囊胚形成的各項(xiàng)指標(biāo)并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有學(xué)者[13]通過研究凍融周期中胚胎質(zhì)量與囊胚形成之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)7- 9細(xì)胞與>9細(xì)胞胚胎之間囊胚形成率相當(dāng)，這與我們的研究結(jié)果一致。之前普遍認(rèn)為D3為8細(xì)胞階段的胚胎是理想的移植胚胎。但也有一些研究顯示[14]發(fā)育較快的胚胎與8細(xì)胞胚胎有同等的臨床結(jié)局,最近也有學(xué)者通過Time-lapse 挑選發(fā)育速度較快的胚胎移植，也獲得較好的妊娠結(jié)局[15]。

胚胎發(fā)育過慢，往往預(yù)示著發(fā)育潛能較低,生長較慢的胚胎異常的發(fā)生率比正常發(fā)育速度的胚胎明顯更高，胚胎質(zhì)量較差導(dǎo)致移植后的臨床妊娠率較低[16]。我們的結(jié)果也顯示4- 6細(xì)胞組和<4細(xì)胞組的囊胚形成各項(xiàng)指標(biāo)都要遠(yuǎn)低于> 6細(xì)胞的胚胎。對(duì)于D3發(fā)育速度較慢的胚胎，可利用囊胚形成率低，不過仍有部分具有發(fā)育至囊胚的潛能。因此在臨床工作中，我們需在患者的囊胚培養(yǎng)費(fèi)用和避免胚胎浪費(fèi)等方面做出平衡，根據(jù)患者的不同情況綜合考量這部分胚胎是否要行囊胚培養(yǎng)。

除了卵裂球數(shù)目是影響囊胚形成的一個(gè)重要因素外，胚胎碎片也與囊胚形成有關(guān)。碎片的形成可導(dǎo)致染色體異常，影響囊胚的形成。研究表明，移除碎片可以明顯降低Ⅳ期胚胎的凋亡指數(shù)，有助于優(yōu)質(zhì)囊胚的形成[17]。 本研究的結(jié)果也顯示碎片率較高的胚胎繼續(xù)發(fā)育為囊胚及可利用囊胚的能力較差。

我們的結(jié)果顯示D3卵裂球不對(duì)稱的胚胎囊胚發(fā)育潛能要低于卵裂球?qū)ΨQ的胚胎(P<0.05)。胚胎不對(duì)稱性的發(fā)生可能影響卵裂球細(xì)胞骨架的變化趨勢和極化，從而影響囊胚的形成。我們的Logistic分析結(jié)果顯示卵裂球均一性同可利用囊胚形成均顯著相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，D3胚胎質(zhì)量與囊胚形成密切相關(guān)。D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的各項(xiàng)指標(biāo)，包括卵裂球數(shù)目、均一性及胚胎碎片等均會(huì)影響到囊胚的形成及質(zhì)量。我們可以通過D3胚胎質(zhì)量預(yù)測其囊胚發(fā)育潛能，為患者提供最佳的個(gè)體化治療方案。