于博文 修成奎 王雪 楊靜 雷燕

(1.中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心 北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室，北京 100700； 2.中國中醫(yī)科學院博士后科研流動站，北京 100700)

細胞間通訊包括細胞間直接接觸和細胞外分泌，近年來，以內(nèi)皮微粒(endothelial microparticles，EMP)為媒介的細胞間通訊日益受到關注。EMP由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，能通過多種方式影響受體細胞的功能。鑒于這種調(diào)節(jié)細胞功能的潛力，學者們認為EMP可作為內(nèi)皮功能障礙和血管健康的生物標志物，也可預測多種疾病并判斷預后。但目前對EMP分子機制的理解還不夠深入，在其研究及檢測方法上存在局限性?，F(xiàn)就近年EMP的研究進展進行綜述，為臨床診療提供一些思考，以期推進EMP作為疾病靶標的轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究。

1 EMP概述

1.1 EMP的概念和病理生理功能

細胞外囊泡是脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，由細胞分泌產(chǎn)生并釋放到細胞外環(huán)境中，在血液、尿液、乳汁、唾液、精液、關節(jié)液或腦脊液中均可被檢測到。根據(jù)其來源、大小和成分，通常分為外泌體、微粒和凋亡小體。微粒是從激活或損傷的細胞上脫落的微小囊泡，由細胞膜向外出芽形成，直徑0.1～1 μm，含胞漿、膜蛋白、RNA和microRNA等。微粒表面具有母體細胞來源的膜磷脂結(jié)構和蛋白質(zhì)成分，并攜帶有母體細胞源的膜表面分子標志物[1]。1976年，Wolf[2]首次證實來源于活化血小板的血小板微粒，并將其命名為“血小板塵?！?。1999年，Combes等[3]首次發(fā)現(xiàn)用腫瘤壞死因子-α刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞能促使其釋放EMP。迄今為止，血小板、淋巴細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌、視網(wǎng)膜、祖細胞和癌細胞等各種類型細胞均被證明可釋放微粒，并根據(jù)其細胞來源命名為EMP和血小板微粒等[4]。

EMP在生理情況下數(shù)量較少，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，這些經(jīng)常被忽視的EMP正逐漸成為內(nèi)皮功能失調(diào)的潛在指標，是反映內(nèi)皮損傷的新標志物。EMP可參與細胞間信息傳遞，具有促凝活性，調(diào)節(jié)凝血與抗凝系統(tǒng)的平衡，且能介導炎癥反應，在血管損傷及生成等過程中也發(fā)揮重要的作用[5]。在病理情況下，血管內(nèi)皮細胞受到外界刺激進后產(chǎn)生的較高水平EMP，可參與各種病理過程，如可通過一氧化氮生物利用度受損，暴露促凝血劑[磷脂酰絲氨酸(PS)或組織因子(TF)]，或轉(zhuǎn)移p38絲裂原活化蛋白激酶，影響內(nèi)皮的動脈粥樣硬化保護功能[6-7]。

1.2 EMP的形成和釋放

EMP的形成和釋放機制尚不十分清楚，主要依賴于體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的研究。除最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子-α外，其他炎性細胞因子[8]、細菌脂多糖[9]、活性氧[10]、纖溶酶原激活物抑制劑[11]、凝血酶[12]以及腫瘤來源的微粒[13]都可導致EMP的產(chǎn)生。另外，物理性刺激如低剪切應力和輻射等也可刺激EMP的釋放[14-15]。

目前研究表明，EMP釋放到細胞外液的具體過程為：細胞受到上述化學性或物理性刺激后，膜鈣通道開放引起鈣內(nèi)流，從而激活鈣蛋白酶，觸發(fā)細胞骨架蛋白(如收縮蛋白和纖維肌動蛋白)的局部降解；同時，膜不對稱性喪失，質(zhì)膜磷脂的不對稱分布被改變，使PS被轉(zhuǎn)移到外層而不能用于與收縮蛋白結(jié)合[16]；最后，激活的肌動球蛋白系統(tǒng)將囊泡的邊緣聚集在一起，以出芽的方式釋放EMP[17]。在該過程中，flipase、floppase和scramblase這三種酶的抑制或激活對維持質(zhì)膜不對稱性至關重要[18]。此外，PS的暴露是通過Rho A重組肌動蛋白細胞骨架來調(diào)節(jié)，Rho的激活是炎癥條件下微粒脫落或凋亡的關鍵因素[19]。

目前對刺激EMP釋放的信號轉(zhuǎn)導分子機制研究較少，例如，氯吡格雷可通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶途徑抑制硫酸吲哚酚誘導的EMP生成[20]。凝血酶通過依賴于RhoA/ROCKⅡ軸的信號通路誘導EMP釋放[12]。在凝血酶激活的內(nèi)皮細胞中也有TRAIL/Apo2L通路的激活，最終白介素(IL)-1和TRAIL以自分泌或旁分泌的方式，刺激EMP的分泌[21]。

2 EMP在臨床中的研究進展及應用

2.1 EMP信使作用表現(xiàn)為促炎、促凝及影響血管生成

EMP信使作用的物質(zhì)基礎是其含有豐富的母體細胞來源的胞膜成分及胞質(zhì)成分，如表面受體、白細胞分化抗原分子(CD)、PS、TF、細胞因子、脂質(zhì)及mRNA和microRNA等[5]。EMP可作為“傳送器”和“信號體”，通過激活受體和/或直接將微粒內(nèi)容轉(zhuǎn)移到靶細胞，傳遞參與細胞黏附、趨化和血管生成的生物活性分子，同時將信息從微粒釋放細胞傳遞給靶細胞，補充了傳統(tǒng)的細胞間通訊途徑。因此，雖然EMP只代表外周循環(huán)中的一小部分細胞微粒，但仍被認為是向周圍環(huán)境傳遞重要生物學信息的載體[1]。

然而，目前尚不清楚EMP是否通過旁分泌途徑或細胞與EMP的直接接觸，從而對其靶細胞產(chǎn)生影響。有研究表明，EMP可通過將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞表面而起作用，EMP還能通過暴露膜結(jié)合分子間接影響靶細胞，并最終激活靶細胞受體從而誘導特異性反應[22]；也有研究證實其作用機制類似于吞噬作用，涉及清道夫受體或PS受體[23]。此外，EMP和靶細胞之間的膜融合也可能觸發(fā)細胞活化[24]。因此，概括EMP靶向效應細胞的機制可能有兩種：第一種是通過微粒與膜受體或整合素的相互作用，刺激細胞內(nèi)信號傳導；第二種是通過膜融合或內(nèi)吞作用，將微粒中的成分“清空”到受體細胞的胞質(zhì)中。

EMP的信使作用主要表現(xiàn)在促炎、促凝反應以及影響血管生成等方面。研究證實，腫瘤壞死因子-α刺激產(chǎn)生的EMP可作為旁分泌介質(zhì)，通過上調(diào)細胞間黏附分子-1、microRNA的表達和從靶細胞脫落的可溶性細胞間黏附分子-1，誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生炎癥反應，而非刺激條件下產(chǎn)生的EMP無此作用[25-26]。因此，這種旁分泌效應受EMP產(chǎn)生條件的影響，提示EMP既是炎癥反應的原因又是結(jié)果。此外，EMP還可作為血管生成的信號，通過激活參與細胞外基質(zhì)降解和生長因子釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶，在組織重塑和血管生成中起關鍵作用[27]。

EMP還可介導促凝，活化細胞產(chǎn)生的EMP在體外可誘導TF依賴性凝血酶形成，在體內(nèi)則誘導血栓形成，這表現(xiàn)為正常血漿的凝固時間隨EMP含量的增加而縮短。由于內(nèi)皮黏附分子的表達，TF+EMP可與單核細胞等其他細胞結(jié)合，從而增強促炎和促凝反應[28]；這種促凝血反應也可能與TF從TF+EMP上轉(zhuǎn)移到活化血小板上有關[29]。此外，EMP富含PS的表面可催化凝血蛋白及其復合物的組裝[6]。因此，通過暴露PS和TF，EMP可能作為生物載體在促凝潛能的傳播中發(fā)揮作用。

2.2 EMP是新的生物標志物及臨床預測指標

EMP是內(nèi)皮功能障礙及血管健康的新的生物標志物。評估內(nèi)皮功能障礙的傳統(tǒng)方法有：多普勒血流檢測內(nèi)皮依賴性血管舒張、靜脈閉塞造影、正電子發(fā)射斷層顯像冠狀動脈灌注冷加壓試驗、激光多普勒血流測量和超聲等[30]。這些評估方法的缺陷在于具有侵襲性，并且與實際內(nèi)皮功能相關性差，因此需新的內(nèi)皮功能替代指標。而揭示EMP在內(nèi)皮功能障礙中的生物學意義可能預示著血管健康、風險分層和疾病進展的新型無創(chuàng)監(jiān)測平臺的出現(xiàn)。EMP亞群的計數(shù)和表型分類與許多疾病中的內(nèi)皮功能障礙有關。在出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙的患者中，循環(huán)EMP水平與血流介導的擴張幅度呈負相關，與年齡和壓力無關[31]。對年輕健康受試者，急性內(nèi)皮損傷如二手煙會迅速損害內(nèi)皮功能并增加循環(huán)EMP水平[32]。近年來，結(jié)合EMP和內(nèi)皮祖細胞水平的多標志策略作為血管健康的綜合標志物也引起了人們的關注。EMP與內(nèi)皮祖細胞比值的變化可能反映了內(nèi)皮損傷和修復之間的不平衡，這可能有助于鑒別血管損傷[33]。

EMP還可作為多種疾病的生物標志物及預測指標，在冠狀動脈疾病、心肌梗死、血栓、慢性心力衰竭、肺動脈高壓、卒中、高血壓、糖尿病以及腎衰竭等多種疾病中，EMP被視為各病理過程正在進展或過度激活的潛在生物標志物[34]。目前心血管危險分層使用的非特異性指標，如Framingham危險評分、腦鈉肽和高敏C反應蛋白，在預測冠心病高危穩(wěn)定患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生方面是不夠的。Nozaki等[35]報道血漿EMP水平可獨立預測冠心病高?；颊呶磥硇难苁录?，用EMP評估內(nèi)皮功能障礙的多種生物標志物策略可識別易患心血管疾病的人群。此外，在無癥狀個體中，循環(huán)EMP與動脈粥樣硬化血栓形成風險增加相關，因此可能提供潛在的預測價值[36]。

2.3 EMP用于判斷預后

部分研究也探討了血漿EMP水平的預后判斷潛力。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，化療后循環(huán)EMP水平的降低與更好的總體生存率和無病生存率相關，并且可能作為血管生成相關的預后指標，效果優(yōu)于血管內(nèi)皮生長因子A水平[37]。在冠心病高風險受試者中，表達血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的EMP基線水平可判斷預后，并且與Framingham危險評分、C反應蛋白和腦鈉肽水平無關[38]。在慢性腎功能衰竭中也有類似的發(fā)現(xiàn)，其中高水平CD31+CD41-EMP是心源性死亡的獨立預測因子，而其他血漿微粒亞群則無預后判斷價值[39]。綜上，EMP在內(nèi)皮功能、多種疾病及預后中均可作為一種評價和預測指標。

2.4 EMP在臨床治療中的價值

EMP評價可為有癥狀和無癥狀患者的臨床治療提供一定的參考，監(jiān)測導致EMP形成的過程可能與控制疾病進展有關，靶向EMP的治療手段可能是一項新的挑戰(zhàn)。研究表明，黃連素可通過減少循環(huán)CD31+/CD42-EMP介導的血管內(nèi)皮氧化應激，改善內(nèi)皮功能[40]?？寡趸瘎?如維生素C)可改善糖尿病患者和心肌梗死后血脂異常患者的循環(huán)EMP水平[41]。他汀類藥物對EMP釋放也有影響，但仍存在爭議：一方面，臨床相關濃度的他汀類藥物可通過抑制異戊烯化作用，刺激內(nèi)皮細胞分離和EMP釋放；另一方面，他汀類藥物可能對內(nèi)皮細胞具有抗炎作用，抑制Rho激酶途徑，導致EMP釋放減少[42]。循環(huán)缺氧相關疾病(CHRD)，如急性冠脈綜合征、卒中和器官移植，與EMP也密切相關。EMP有助于CHRD表型的識別和疾病嚴重程度的分層，改善CHRD發(fā)生的危險分層及CHRD患者的預后[21]。Francois等[43]報道，限制碳水化合物可減少循環(huán)EMP，有效緩解餐后高血糖，并改善2型糖尿病患者的內(nèi)皮功能。此外，微粒作為治療糖尿病相關心臟、腎臟、周圍神經(jīng)和視網(wǎng)膜損傷的靶點，也顯示出巨大的前景。藥物控制細胞膜磷脂部分及微粒脫落過程可能有助于控制糖尿病腎病和血管老化[44]。

3 EMP的雙面作用

目前研究主要集中在病理狀態(tài)下的EMP上，因此EMP很容易被誤認為是純粹有害的。然而，健康個體中存在基本水平的EMP，具有潛在的細胞保護蛋白和受體[45]。EMP對內(nèi)皮完整性也具有潛在有益作用，如刺激血管修復，控制細胞死亡機制或抗原呈遞細胞支持的細胞保護活性以及誘導適應性免疫。在膿毒癥中，EMP最初被認為是傳遞對內(nèi)皮功能有害的生物信息，進而引發(fā)凝血和死亡。事實上，EMP通過攜帶功能性內(nèi)皮蛋白C受體和抗原呈遞細胞在膿毒癥中具有有益的作用。此外抗原呈遞細胞陽性的EMP能抑制促凝微粒的釋放，并通過減少細胞凋亡對內(nèi)皮細胞具有保護作用[46]。EMP還可通過Akt/eNOS信號和減少氧化應激預防脂質(zhì)誘導的內(nèi)皮損傷[47]。還有研究表明，EMP可利用血液代謝物合成還原型輔酶Ⅱ，為其抗氧化機制提供燃料。并且衰老EMP比年輕EMP具有更強的活性氧清除能力[48]。

EMP在促進血管生成方面也可能有雙面作用。EMP可能是缺血組織血管修復的內(nèi)源性生存信號，但促進血管生成也可能對癌癥擴散、增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變或動脈粥樣硬化斑塊失穩(wěn)產(chǎn)生影響[49]。以上研究表明，EMP在各種生理過程中具有復雜而矛盾的作用，可促進或抑制凝血、炎癥或血管生成。EMP具有有益作用的關鍵是其血漿水平保持適當平衡，過量或不足都會產(chǎn)生不利影響[45]。

4 EMP的檢測方法及在臨床研究中存在的問題

盡管顯微鏡、酶聯(lián)免疫吸附試驗及功能測定等方法均可用于微粒檢測，但流式細胞術是目前微粒分析的金標準，能分析大量微粒和提供有關微粒特性的信息，并可進行多重標記[50]。其具體方法為：首先用已知直徑的標準微球進行尺寸校準，圈定0.1～1 μm范圍的門；其次對EMP進行標記，同時定量。標記EMP常用的方法有兩種，一是當血管內(nèi)皮細胞被不同病理因素刺激時，會產(chǎn)生不同表型的EMP，常被作為檢測EMP的標志物。用EMP自身帶有的特異性抗原標記抗體、結(jié)合及測定。常用的標志物有CD144+、CD106+、CD62E+和CD31+/CD42b-。二是用Annexin-V測定PS+EMP，Annexin-V是Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，與PS有超強的親和力。定量EMP也有兩種方法：一是在分析前的樣品中加入已知濃度和體積的微球，間接計算樣品微粒濃度；二是預先確定流式細胞儀的流速，則可計算每個分析體積的樣品微粒數(shù)[51]。

然而，目前EMP在臨床研究中存在一定的局限性。各種分析前變量，如樣本采集、離心轉(zhuǎn)速、緩沖液、試劑和凍融等因素均可能對分析結(jié)果產(chǎn)生影響[52]。此外，用Annexin-V分析EMP時只能檢測到表面帶有PS的EMP亞群，可能導致測量的不全面性。內(nèi)皮細胞上Anexin-V結(jié)合位點的顯著增加只發(fā)生在凋亡中，并且優(yōu)先富集在由凋亡內(nèi)皮細胞衍生的EMP上，這可能導致因內(nèi)皮細胞活化而釋放的EMP無法被檢測到[51]。EMP的異質(zhì)性以及用單一標志物標記總EMP的效率低下，導致了當前臨床研究中EMP水平差異較大。因此，檢測方法的優(yōu)化和標準化對于正確定量EMP具有重要意義。目前，對EMP體內(nèi)釋放時間窗的研究還不多見，對循環(huán)中微粒清除機制的研究也很有限。

5 小結(jié)和展望

越來越多的證據(jù)表明，EMP是新的生物信息傳遞者并且與多種疾病病理過程密切相關。進一步研究EMP釋放和清除的具體觸發(fā)因素，探索EMP在何時以及如何發(fā)揮不同的作用，有助于將其生物學意義延伸至疾病風險分層和預測分析，從而全面地監(jiān)測血管健康，在臨床癥狀明顯之前即可預知疾病?？偟膩碚f，目前對微粒的組成、產(chǎn)生和靶向性的理解非常有益。隨著研究的深入，EMP的作用將一步步被揭示，這可為日后評價疾病提供新的信息，為從新的角度看待疾病提供支點，也會為轉(zhuǎn)化醫(yī)學領域如診斷和治療開創(chuàng)新的契機。EMP成為藥物靶點或藥物載體的潛力令人期待，它開啟了許多研究領域，最終將使患者受益。