◎ 范 蕊，王文文，盧 彬

（新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆 烏魯木齊 830011）

食品衛(wèi)生安全問題是全球各個國家都普遍關(guān)注的重要內(nèi)容，是人們?nèi)粘Ｉ詈蜕鐣€(wěn)定發(fā)展的重要條件，而微生物所造成的食源性疾病則成為影響食品安全衛(wèi)生的關(guān)鍵一環(huán)。

1 食源性致病微生物快速檢測技術(shù)研究的意義

世界衛(wèi)生組織在2002年發(fā)布的一份報告中表明，全球各國每年發(fā)生的食源性疾病達到了數(shù)十億例，即使是發(fā)達國家也存在至少35%的居民患有或正在患食源性疾病。絕大多數(shù)食源性疾病是由細(xì)菌所引發(fā)的，食源性致病細(xì)菌中，沙門菌、志賀菌、單增李斯特菌和變形桿菌等，都屬于較常見的致病菌，這些致病菌往往會引發(fā)一些嚴(yán)重的重大事件[1-2]。

在2011年，美國就曾經(jīng)發(fā)生了由單增李斯特菌所引發(fā)的食源性疾病事件，從7月末到10月初的短短60多天內(nèi)，50%以上的自治州共出現(xiàn)了110例食源性病例報告，是近20年美國發(fā)生的性質(zhì)最為嚴(yán)重的一次疾病發(fā)作事件[3-4]。食源性疾病在我國也時有發(fā)生，幾乎每年都有食物中毒、食品衛(wèi)生事件的報道出現(xiàn)，使消費者對食品制造加工、工農(nóng)業(yè)以及消費品等行業(yè)的信心受到了嚴(yán)重的影響。

雖然當(dāng)前我國在對食源性致病菌的微生物檢測檢驗方面具有成型的常規(guī)檢測檢驗方式，但這些方式方法通常都要在實驗室內(nèi)進行，檢驗過程包含了對致病菌的采集收集、培養(yǎng)克隆、分離觀測等環(huán)節(jié)，不但需要耗費一定的物資和人員精力，而且需要較長的時間周期。再加上我國在相關(guān)檢測的試劑和器皿等方面無法實現(xiàn)完全配套適應(yīng)，因此對于公共食品衛(wèi)生安全事件的快速應(yīng)急反應(yīng)處置還無法滿足實際需要。

近幾年以來，越來越多的研究機構(gòu)和科研人員意識到了食源性致病菌的快速檢測技術(shù)研發(fā)的重要性。微生物檢測最重要的是準(zhǔn)確性，雖然快速檢測法并不能完全確保檢測結(jié)果的正確性，但可以通過快速檢測法，辨別出符合檢測標(biāo)準(zhǔn)的樣本，剔除不符合檢測檢驗條件及標(biāo)準(zhǔn)的樣本，從而達到提升檢測效率的目的。得益于科學(xué)水平的進步，快速檢驗技術(shù)水平也得到了較大的提高。

2 常見檢測方法與技術(shù)

2.1 免疫檢測法

2.1.1 酶免疫技術(shù)

免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機結(jié)合的一種方法。它以酶作為標(biāo)記物，與相應(yīng)的抗原或抗體作用后，通過底物的顏色反應(yīng)進行定性和定量分析，亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究?；诿该庖叩臋z測方法按照抗體與抗原的反應(yīng)是否需要對游離的酶生物標(biāo)記部分的不同結(jié)果可以分為兩種不同的類型，即均相法和非均相法，其中最為常見的是非均相法，其中又包括了固相形態(tài)免疫法和非固相形態(tài)免疫法。

2.1.2 熒光免疫技術(shù)

作為免疫檢測技術(shù)中最早出現(xiàn)的一種方法，熒光免疫檢測法是以生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)以及顯微鏡技術(shù)為基礎(chǔ)從而建立起來的?？蒲腥藛T利用微生物抗原抗體分子和示蹤物質(zhì)之間的結(jié)合，根據(jù)抗原抗體的反應(yīng)特異性來定位組織細(xì)胞的內(nèi)抗物質(zhì)。這種技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對金黃色葡萄球菌、沙門菌以及單增李斯特菌等致病菌的快速檢測。

2.1.3 酶聯(lián)熒光技術(shù)

當(dāng)前食源性致病細(xì)菌的測試鑒定技術(shù)中采用基礎(chǔ)最大的是酶聯(lián)熒光檢測鑒定法，這項技術(shù)的原理是充分運用已知抗原體的強吸附性，將其與微生物微量檢測反應(yīng)板中的固體形態(tài)載體相連接，固相載體的表面因此產(chǎn)生酶標(biāo)記物抗原體結(jié)合反應(yīng)，隨后再將液相里的游離成分進行洗滌清除。

2.2 生物分子檢測法

2.2.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，其特點是反應(yīng)速度快，可以在較短的時間內(nèi)將微量樣本中的特定片段擴大數(shù)百萬倍，是當(dāng)前食品微生物致病菌檢測當(dāng)中較為常見的一項技術(shù)，得到了較為廣泛的應(yīng)用。雖然該項技術(shù)具有簡便、靈活、成本低等特點，但由于市面常見檢測方法與之結(jié)合程度不高，因此無法實現(xiàn)精確定量檢測。

2.2.2 基因芯片技術(shù)

分子生物學(xué)近年來重大進展之一就是基因芯片技術(shù)，該技術(shù)是采用雜交序列測試法，把一組已知序列核酸的探針之間進行相互雜交，并進行核酸序列的測試定性。由于該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)同一時間固定較大數(shù)量的核酸探針，因此能夠?qū)z測樣品的大規(guī)模序列進行分析檢驗，大大改善了傳統(tǒng)技術(shù)中存在的操作復(fù)雜、檢測序列數(shù)量少、半手動化、工作效率不高等缺陷，在眾多檢測技術(shù)中具有明顯的優(yōu)勢。

2.3 傳感器檢測法

2.3.1 電化學(xué)基因傳感技術(shù)

電化學(xué)技術(shù)近幾年以來在生物核酸傳感方面的實踐與應(yīng)用上取得了很大的進展，該項技術(shù)的核心是利用電化學(xué)的核酸探針能夠判斷基因是否存在這一特點，通過檢測器在特定環(huán)境與條件中，對探針發(fā)出的不同電極、光源信號變換進行監(jiān)測和識別，并根據(jù)結(jié)果來判定靶向生物分子是否存在。由于該技術(shù)具有明顯的便攜性、靈敏性特點，同時兼具低成本、低功率、低消耗優(yōu)勢，再加上其對樣品的保護程度高，器具結(jié)構(gòu)微型，在食源性微生物領(lǐng)域的發(fā)展前景非常的廣闊[5]。

2.3.2 核酸檢測微流控技術(shù)

核酸檢測微流控制技術(shù)是將微機械電子系統(tǒng)作為基礎(chǔ)，建立微型閥、微型泵、微型控制器和微型傳感器等單元結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)化學(xué)分析檢測各環(huán)節(jié)之間的集約、連續(xù)和微型化。該技術(shù)最明顯的特點是能把控制多種問題檢測的技術(shù)單元集成在小體積靈活控制且具有規(guī)模性的平臺中，不但能夠大幅度降低人工操作造成的失誤與差別，還能有效減少檢測時間、壓縮檢測成本，因此該技術(shù)在食源性致病源微生物檢測中能夠發(fā)揮出靈活、簡單、便捷的特點。

2.4 DNA探針檢測技術(shù)

該項技術(shù)主要是運用已知序列的DNA片段與未知序列DNA片段之間的雜交，并用特有方式進行探知和標(biāo)記，具有突出的靈活性和特異性，同時還兼具了化學(xué)染色的顯性特點和定位性。在技術(shù)運用測試實驗中，能夠?qū)θ舛揪⒋竽c桿菌、單增李斯特菌和霍亂菌等食源性致病微生菌原體表現(xiàn)出明顯的特異性和敏感性，雖然沙門菌與結(jié)腸菌等有交叉反應(yīng)，但對檢測結(jié)果不構(gòu)成實質(zhì)影響。

2.5 阻抗檢測法

這是一種利用微生物新陳代謝引發(fā)培養(yǎng)基電極特性變動而對檢測樣品微生物的成分與含量進行檢查和測定的方法。檢測樣品中微生物的新陳代謝能夠讓培養(yǎng)基中具有惰性的電分子物質(zhì)轉(zhuǎn)換為具有電活性的小分子物質(zhì)，例如把脂肪、碳水物等轉(zhuǎn)化為蠟酸鹽、氨基酸等物質(zhì)。在微生物新陳代謝過程中，培養(yǎng)基里的惰性物質(zhì)被具有活性的電分子取代，提高了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，根據(jù)細(xì)胞活性判定其是否具有致病性，檢驗食品中活細(xì)胞數(shù)量對食品安全檢驗具有明確的實際意義。

2.6 傳感器技術(shù)

2.6.1 生物傳感器檢測法

這種檢測法主要是通過生物傳感器實現(xiàn)檢測功能。生物傳感器問世20世紀(jì)60年代，在80年代形成一定的規(guī)模和固定研究領(lǐng)域，其主要是把固定化的生物敏感材料作為識別元件，再配上恰當(dāng)?shù)男盘杺鲗?dǎo)裝置，最終構(gòu)成檢測分析工具。這種工具按照生物元件的不同分為微生物、免疫功能以及酶物質(zhì)傳感器等類型，優(yōu)點是靈活程度高、檢測成本低且器具體積小，能夠在腐壞變質(zhì)或即將腐壞變質(zhì)的食物中獲得迅速、實時以及多種復(fù)雜情況的檢測分析結(jié)果。

2.6.2 免疫傳感器檢測法

免疫傳感器檢測法是一種采用新型生物傳感器實現(xiàn)免疫檢測的方法，該傳感器的結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的生物傳感器具有高度一致性，其主體結(jié)構(gòu)由數(shù)據(jù)信息處理單元、生物特性感知單元和換能處理單元組成，與傳統(tǒng)技術(shù)的區(qū)別在于檢測樣本和傳感器識別單元結(jié)合之后，產(chǎn)生的物體將生物信號經(jīng)換能單元變成可被識別的光電信號，尤其是電化學(xué)信號的質(zhì)量好，無論在精確程度、可選范圍、存儲質(zhì)量以及信號清晰度方面，都具有明顯優(yōu)勢，但是對比我國2010年出臺的檢測操作規(guī)定而言，檢測時長最短需達到一周左右，因此不具備實際操作性。

2.7 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

該技術(shù)的原理是，通過蛋白質(zhì)陣列放大食品中所含蛋白質(zhì)的生物活性，這一技術(shù)主要通過蛋白質(zhì)芯片實現(xiàn)。蛋白質(zhì)芯片是由數(shù)量巨大的蛋白質(zhì)、生物探測單元、蛋白質(zhì)活性檢測試劑按照設(shè)計好的序列排列在固定器皿載體中所形成的陣列或微型陣列，能夠提高食品蛋白質(zhì)活性檢測的數(shù)量，增加蛋白質(zhì)與分子之間的相互作用，實現(xiàn)了生物蛋白質(zhì)活性測試的高通量及定向測量，在食品安全及生命安全等科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展有重大影響作用。

2.8 納米金檢測技術(shù)

納米金技術(shù)又可以稱為金染色免疫法，出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，其標(biāo)記物體是納米等級的金質(zhì)顆粒，納米金指的是直徑在1～100 nm的微小金顆粒，因顆粒的表層具有負(fù)極電離子，對靜電有明顯的排斥作用，在液相中可以長久保持穩(wěn)定形態(tài)，形成穩(wěn)定的膠體。該物質(zhì)的特性是高電子密度介電性，同時還有催化功能，在與大多數(shù)生物因子結(jié)合時候保持原有活性，目前已經(jīng)在免疫細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、生物標(biāo)記技術(shù)等方面，在食品安全性檢測中發(fā)揮了重要作用，是食源性致病菌原體快速檢測及微生物研究中常見的技術(shù)，適用于多種類型的檢測，通過在納米金顆粒表面標(biāo)記上特定的寡核苷酸探針以及對納米金顆粒表面特性的處理，開發(fā)出了一系列新的生物檢測系統(tǒng)，為分子級別領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)快捷檢測致病微生物提供了技術(shù)基礎(chǔ)，甚至能夠檢測出致病源菌的耐藥性變異情況，對大腸埃希氏菌、沙門菌、志賀氏菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等具有高靈敏度和特異性[6]。

3 研究現(xiàn)狀

我國南京工業(yè)大學(xué)科研團隊于2018年全球首次開發(fā)出了基于熒光素酶的系列食源性致病菌快速檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌O157、奇異變形桿菌及產(chǎn)氣腸桿菌肺炎克雷伯氏桿菌的單獨和混合檢測，最低檢測限達10 CFU，與傳統(tǒng)食品菌落檢測儀和熒光定量PCR法相比，該系統(tǒng)具有更高的特異性，可以將檢測時間縮短至2～3 h，且設(shè)備、試劑成本相對較低，與現(xiàn)有系列食源性致病菌檢測系統(tǒng)相比，具有極大的競爭優(yōu)勢。細(xì)菌的識別檢測在疾病防控、臨床診斷以及食品衛(wèi)生安全等領(lǐng)域具有重要研究價值和實用意義，建立快速靈敏的細(xì)菌檢測新技術(shù)和新方法已經(jīng)成為國內(nèi)外研究熱點。這款食源性致病菌快速檢測系統(tǒng)，體現(xiàn)了快速靈敏的細(xì)菌檢測技術(shù)，為實現(xiàn)細(xì)菌檢測微型化、自動化和實時現(xiàn)場檢測提供新途徑和廣闊前景，對疾病控防、臨床診斷以及食品衛(wèi)生安全等領(lǐng)域具有重要研究價值和實用意義[7]。

2019年初，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科研團隊利用微流控技術(shù)實現(xiàn)食源性致病菌的快速、靈敏檢測。微流控技術(shù)近年來發(fā)展迅速，芯片集成的單元部件越來越多，集成規(guī)模也越來越大，同時微流控芯片可以大量平行處理樣本，具有高通量、分析速度快、物耗低、污染小的特點，使之為材料學(xué)、化學(xué)、生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)與應(yīng)用提供了一個有力的平臺。這種新型的食源性致病菌檢測技術(shù)，先利用同軸通道和二氧化硅磁珠進行DNA提取和富集，再利用融智生物微流控核酸定量分析平臺QuanPLEX和微流控芯片進行DNA擴增和檢測，可在2 h內(nèi)檢出低至12 CFU·mL-1的大腸桿菌O157∶H7，實現(xiàn)了食源性致病菌的快速、靈敏檢測。傳統(tǒng)檢測技術(shù)對PCR技術(shù)的依賴程度較高，在市面中常見的常規(guī)PCR、免疫PCR、微控PCR、實時PCR及多重PCR等技術(shù)中，微控PCR以操作自動化、檢測成本低、檢測時間快及交叉污染少等特性受到越來越多的關(guān)注，因其快捷、高效、靈活等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用在食源性微生物的快速檢測領(lǐng)域，但是從復(fù)雜食品樣本中提取核酸的技術(shù)研究卻鮮有人關(guān)注。這些方法通常操作較復(fù)雜、勞動強度較大、耗時較長且存在重現(xiàn)性和毒性試劑等局限性。更重要的是，它們不適用于從大量樣本中提取少量靶向DNA。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研究中所用的微流控核酸定量分析平臺是融智生物QuanPLEX食品安全微生物快速檢測系統(tǒng)。QuanPLEX是一款符合國標(biāo)的食品微生物快檢系統(tǒng)，可同時檢測32個指標(biāo)；檢測速度快，比傳統(tǒng)qPCR檢測速度提高一倍以上；安全性好，封閉式芯片可避免氣溶膠污染；極簡前處理，一鍵式操作軟件，操作簡便。在檢測大體積樣品中低濃度大腸桿菌O157∶H7中表現(xiàn)出了巨大潛力，將傳統(tǒng)的細(xì)菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)的靈敏度提高了近百倍，有望實現(xiàn)食源性致病菌的現(xiàn)場、快速、多目標(biāo)檢測，切實保障食品安全[8]。

4 展望

目前，傳統(tǒng)的食源性病原菌的檢測、鑒定仍停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定和血清學(xué)分型水平。這些方法操作煩瑣、需要時間較長、準(zhǔn)備和收尾工作繁重，檢測周期較長，而且無法對難以培養(yǎng)的病原菌進行檢測，因此病原微生物的檢測結(jié)果往往存在不同程度的滯后性。這不僅不利于食品安全管理體系及時驗證控制措施實施效果，而且不利于對潛在不安全產(chǎn)品迅速采取糾正和糾正措施。對食源性致病菌進行準(zhǔn)確、靈敏、省時、省力和省成本的快速檢驗方法已經(jīng)成為保證食品安全的迫切需求[9]。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對食品安全的重視程度的不斷增強，食品中致病性病原微生物的快速檢測將在食品工業(yè)原料質(zhì)量估測、加工工藝評估、成品質(zhì)量檢測、產(chǎn)品貨架期預(yù)測等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用，在食品安全管理體系的建立和實施中發(fā)揮越來越重要的作用。這些快速檢測技術(shù)的推廣應(yīng)用，不僅是對傳統(tǒng)的食品安全檢測技術(shù)的一個改進和提高，也使食品質(zhì)量安全有了進一步的保證，從而推動食品工業(yè)更加健康、快速向前發(fā)展，改變?nèi)祟惖纳钯|(zhì)量，滿足人民提高健康水平的需要。我國采用的大多數(shù)是國外的快速檢測技術(shù)，檢測成本高，缺乏相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)。在以后的工作中，應(yīng)采取多種方法，引進、消化國外的先進技術(shù)，生產(chǎn)出我國自己的快速檢測產(chǎn)品。同時積極組織研究所、大專院校和企業(yè)的專家建立國家標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，推動我國快速檢測技術(shù)的發(fā)展[10]。