羅俊霞，趙建波，張剛，楊華，張啟成，王清

1. 鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心（鄭州 450006）；2. 鄭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心（鄭州 450006）；3. 河南恒晟檢測技術(shù)有限公司（鄭州 451100）

隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高，食品安全問題越來越引起人們的關(guān)注，也受到各級政府部門的重視。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥的使用有助于降低作物病蟲草害，提高作物的產(chǎn)量，但過量使用則會引起農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題[1-3]。我國農(nóng)藥的生產(chǎn)量和使用量在全世界排名第一[4]，生產(chǎn)中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥由于其價格低、殺蟲譜廣等優(yōu)點在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用，20世紀(jì)80年代至21世紀(jì)初期，其使用量最多時占到農(nóng)藥總產(chǎn)量的70%以上[4]，其殘留超標(biāo)問題遠(yuǎn)高于其他類農(nóng)藥等問題[5-6]。因此，加強(qiáng)農(nóng)藥殘留的檢測力度，對農(nóng)產(chǎn)品的安全進(jìn)行風(fēng)險監(jiān)測與評估刻不容緩。現(xiàn)有的農(nóng)藥殘留檢測方法有色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、光譜法[7-9]、生物傳感器法[10-11]等，這些方法定量定性較為準(zhǔn)確，但是耗時費力，對檢測人員要求較高。目前公認(rèn)的較為快速的檢測方法是酶抑制法，這種方法在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測監(jiān)管工作一線被廣泛應(yīng)用于樣品的初篩，但是這種方法也存在種種弊端，如不能定量也不能定性[12]、同一種酶對不同的農(nóng)藥敏感性不一樣[13-16]、不同的酶對同一種農(nóng)藥的敏感性也不同[17]。為了了解商品化的酶抑制-比色法快速檢測農(nóng)藥殘留的試劑盒對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性，特安排此次試驗，希望對使用者在購買商品化的酶抑制-比色法農(nóng)殘速測試劑盒時起到一定的指導(dǎo)作用，從而更好地服務(wù)于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的監(jiān)管工作。

1 試驗部分

1.1 試驗儀器與試劑

CL-BIII型16通道的農(nóng)殘速測儀（上海博納新技術(shù)研究所、上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司）；SHA-C型雙重恒溫水浴振蕩器（杰瑞爾電器有限公司）；HH.W21-Cr 420型電熱恒溫水浴鍋（北京三二八科學(xué)儀器有限公司）；WH-861型漩渦混合器；Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液槍；農(nóng)藥殘留檢測試劑盒的品牌分別是深圳市A試劑盒、廣州B試劑盒、廣東C試劑盒、廈門D試劑盒、湖北E試劑盒、深圳F試劑盒。

由農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研檢測所生產(chǎn)的質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、克百威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，使用時按照需要稀釋成80 μg·mL-1的儲備液。

1.2 試劑配制

各品牌的農(nóng)藥殘留檢測試劑盒里有緩沖試劑、酶試劑、顯色劑和底物，在每次使用前，緩沖試劑用500 mL的蒸餾水溶解，酶試劑、顯色劑和底物分別按照各試劑盒說明書的要求進(jìn)行配制；具體見表1。

1.3 試驗設(shè)計

此次試驗為三因素試驗，分別為試劑盒品牌、農(nóng)藥種類、樣品提取液的取用量；對1.1小節(jié)中第一個因素，每一種農(nóng)藥分別設(shè)置5個濃度梯度，按照樣品稱樣2 g，模擬加入農(nóng)藥后樣品的實際濃度為0.05，0.5，1，2和3 mg/kg，每一個濃度設(shè)置3次重復(fù)；根據(jù)緩沖溶液或者樣品提取液的取用體積，針對每一種農(nóng)藥的每一個濃度設(shè)置兩個處理，為取用3 mL提取液或者2.5 mL提取液。

1.4 對照液的測試

分別移取3 mL或者2.5 mL緩沖溶液于10 mL試管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的顯色劑，用旋渦混合振蕩器混勻，再用電熱恒溫水浴鍋在37 ℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物搖勻，立即放入儀器比色池中，用CL-BIII型16通道的農(nóng)殘速測儀測定3 min內(nèi)的吸光度變化值，分別設(shè)定為3 mL或者2.5 mL的取用體積條件下的ΔA的值。

表1 幾個品牌酶抑制法速測試劑盒中各種試劑的配制方法表

1.5 樣品處理

樣品處理參照GB/T 5009.199—2003[18]進(jìn)行。將1.3小節(jié)中制備的模擬樣品（5個濃度梯度的農(nóng)藥）中加入10 mL緩沖液，用雙重恒溫水浴振蕩器振蕩提取10 min，然后分別移取3 mL或者2.5 mL的樣品提取液于10 mL試管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液（B按照說明書加酶20 μL）、0.1 mL的顯色劑，用旋渦混合振蕩器混勻，再用電熱恒溫水浴鍋在37 ℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物搖勻（B、D按照說明書要求加底物20 μL），立即放入儀器比色池中，用CL-BIII型16通道的農(nóng)殘速測儀測定3 min內(nèi)的吸光度變化值，通過儀器讀出其抑制率。

1.6 試驗數(shù)據(jù)的處理

1) 根據(jù)每一個處理的3次測定值計算出變異系數(shù)，考察每一種試劑盒在檢測過程中的精密度或者測試樣品的重現(xiàn)性。

2) 參照文獻(xiàn)[19-28]的方法，對各品牌試劑盒測定各種農(nóng)藥的3次測定結(jié)果，選取抑制率在100%以下的濃度，對抑制率和農(nóng)藥濃度常用對數(shù)進(jìn)行線性擬合，求出抑制率方程和相關(guān)系數(shù)，根據(jù)抑制率方程計算各種試劑盒測定各農(nóng)藥的半抑制濃度IC50。IC50的計算根據(jù)抑制率方程的Y=50%也就是抑制率為50%時，計算出相對應(yīng)的X軸的值，由此計算出相對應(yīng)的濃度。

3) 各品種試劑盒對各種農(nóng)藥的靈敏度的測定。試驗設(shè)定抑制率為10%時為各種農(nóng)藥的最低檢測限，根據(jù)抑制率方程計算出當(dāng)抑制率為10%時各種農(nóng)藥相對應(yīng)的濃度，為其最低檢測限，記為IC10。

4) 通過（1）～（3）的結(jié)果比較，3 mL和2.5 mL的樣品提取體積對測定結(jié)果的影響。

5) 通過（3）和（4）的結(jié)果比較，同一種商品化的試劑盒對5種不同的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各品牌試劑盒測定樣品的重現(xiàn)性

由表2可知，各品牌的試劑盒測定農(nóng)藥的重現(xiàn)性在所使用的玻璃器皿清洗較好且檢測結(jié)果非異常的情況下都比較好；一般來講，對于同一種試劑盒測定同一種農(nóng)藥，抑制率越高，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差越小。

2.2 幾種試劑盒測定5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥時抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及檢出限、敏感性的分析和比較

2.2.1 幾種試劑盒測定涕滅威時抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定涕滅威時抑制率與農(nóng)藥濃度的對數(shù)之間均存在良好的線性關(guān)系，無論是3 mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關(guān)系數(shù)均在0.827 3～0.998 7之間。就IC10看，當(dāng)樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、D、B、F、A、C的順序降低；當(dāng)樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照A、E、F、B、D、C的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，A試劑盒、D試劑盒存在較大差異，呈現(xiàn)倍數(shù)關(guān)系，F(xiàn)試劑盒存在的差異最小。

2.2.2 幾種試劑盒測定涕滅威亞砜時抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定涕滅威亞砜時抑制率與農(nóng)藥濃度的對數(shù)之間均存在良好的線性關(guān)系，無論是3 mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關(guān)系數(shù)均在0.897 6～0.976 5之間。就IC10看，當(dāng)樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、F、B、A、D、C的順序降低；當(dāng)樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、F、B、D、C的順序降低。由于各試劑盒對涕滅威亞砜均極敏感，因此在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，各試劑盒均存在較明顯差異，但于實際的檢測工作沒有意義。

表2 各品牌試劑盒測定幾種農(nóng)藥的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差對照表

表3 各種試劑盒對4種農(nóng)藥的抑制率方程及最低檢測限對照表

2.2.3 幾種試劑盒測定涕滅威砜時抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定涕滅威砜時抑制率與農(nóng)藥濃度的對數(shù)之間均存在良好的線性關(guān)系，無論是3 mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關(guān)系數(shù)均在0.852 6～0.999 6之間。就IC10看，當(dāng)樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、D、C、F、B、A的順序降低；當(dāng)樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照E、D 、F、B、C的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，各試劑盒稍有差異。

2.2.4 幾種試劑盒測定滅多威時抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定滅多威時抑制率與農(nóng)藥濃度的對數(shù)之間均存在良好的線性關(guān)系，無論是3mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關(guān)系數(shù)均在0.881 9～0.992 2之間。就IC10看，當(dāng)樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照D、F、B、A 、C、E的順序降低；當(dāng)樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照F、B、D、C、E的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，各試劑盒稍有差異。

2.2.5 幾種試劑盒測定克百威時抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及檢出限、敏感性的分析和比較

由表3可知，6種試劑盒測定克百威時抑制率與農(nóng)藥濃度的對數(shù)之間均存在良好的線性關(guān)系，無論是3mL的樣品取用量還是2.5 mL的樣品取用量，其相關(guān)系數(shù)均在0.723 7～0.999 4之間。就IC10看，當(dāng)樣品取用量為3 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照F、B、D、E、C、A的順序降低；當(dāng)樣品取用量為2.5 mL時，試劑盒對涕滅威的敏感性按照F、B、D、E、C的順序降低。在3 mL的樣品取用量和2.5 mL的樣品取用量之間，B、D、F試劑盒存在較大差異，但于檢測工作沒有意義。

2.3 同一種試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性比較

由表3可知，就IC10來看，當(dāng)樣品提取液的取用量為3 mL時，A試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威、涕滅威砜、克百威的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5 mL，B試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性按照克百威、涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威、涕滅威砜的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5mL，C試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威砜、涕滅威的順序降低；當(dāng)樣品取用量為3 mL時，D試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性按照克百威、涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威、涕滅威砜的順序降低，當(dāng)樣品取用量為2.5 mL時，D試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性按照克百威、涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威砜、涕滅威的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5 mL，E試劑對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、涕滅威砜、涕滅威、滅多威的順序降低；無論樣品提取液的取用量為3 mL還是2.5 mL，F(xiàn)試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、涕滅威砜的順序降低。

3 討論

GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限》[29]中規(guī)定食品中涕滅威的最小殘留限量為0.02 mg/kg，滅多威的最小殘留限量為0.05 mg/kg，克百威的最小殘留限量為0.02 mg/kg，而涕滅威亞砜和涕滅威砜是涕滅威的代謝產(chǎn)物，其毒性比涕滅威的毒性更高[30]；就IC10來看，部分試劑盒能滿足GB 2763對克百威的限量要求，多數(shù)試劑盒能滿足GB 2763對滅多威的要求，多數(shù)試劑盒不能滿足GB 2763對涕滅威的要求；而在蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測方法NY/T 448[31]和蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測GB/T 5009.199—2003[18]中分別規(guī)定超標(biāo)樣品抑制率為70%和50%，而裘正軍等[32]認(rèn)為抑制率在40%～70%之間，為可疑農(nóng)殘超標(biāo)樣品，需復(fù)查確定，抑制率大于70%，農(nóng)藥殘留濃度較高，可判定為農(nóng)藥殘留超標(biāo)樣品。但是由于酶抑制-比色法快速檢測農(nóng)藥殘留的方法既不能定量也不能定性[12]，就氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測定而言，C試劑盒測定涕滅威時，抑制率達(dá)到50%時農(nóng)藥的濃度為3.786 2和3.864 6 mg/kg，A試劑盒測定克百威時，抑制率達(dá)到50%時農(nóng)藥的濃度為8.055 6 mg/kg，顯然大大高于GB 2763對克百威的限量要求，將抑制率40%～70%的樣品視為可疑樣品時，如果樣品中含有此類農(nóng)藥，顯然漏掉了可疑樣品，因此認(rèn)為當(dāng)抑制率為10%時，可判定該樣品為可疑農(nóng)殘超標(biāo)樣品，需使用色譜、質(zhì)譜進(jìn)行定性定量。

4 結(jié)論

利用各種試劑盒對5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行5個濃度水平的測定，用所測定的抑制率和農(nóng)藥濃度的對數(shù)進(jìn)行線性擬合，相關(guān)系數(shù)在均在0.723 7～0.999 4之間，說明各試劑盒的抑制率和氨基甲酸酯類農(nóng)藥濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系；但是每種試劑盒對各種農(nóng)藥的敏感性均不相同，不同的試劑盒對相同的農(nóng)藥敏感性也不一樣。6種試劑盒均對涕滅威亞砜表現(xiàn)極為敏感，B、F、D試劑盒對克百威也較為敏感。