吳萌萌，栗俊廣，孫芳菲，姜茜，望運(yùn)滔，白艷紅

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450000）；2. 河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（鄭州 450000）；3. 河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心（鄭州 450000）

花生粕是花生仁經(jīng)壓榨和提煉花生油后的副產(chǎn)物。研究表明，花生粕中提取的花生分離蛋白，含有47%～55%的低變應(yīng)原性蛋白和大量必需氨基酸，氨基酸組成合理，可消化率高，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。然而，由于其不良的功能特性，如有限的溶解性、不良凝膠特性，無法滿足食品加工的需求[3-4]。因此需要進(jìn)行適當(dāng)改性，拓展其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。pH偏移技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的蛋白質(zhì)方法，通過將蛋白質(zhì)溶液pH調(diào)整到極端堿性或酸性條件下，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，將pH回調(diào)至中性，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重新折疊，從而改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[5-6]。

肌原纖維蛋白（MP）是肉品中具有重要功能的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)群，其熱誘導(dǎo)凝膠性能對(duì)于肉品加工品質(zhì)有著重要影響[7]。在肉品加工中，常會(huì)加入部分植物蛋白，如大豆蛋白、鷹嘴豆蛋白等，提高肉品的質(zhì)構(gòu)和保水性能。Niu等[8]將改性大豆分離蛋白加入肌原纖維蛋白中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改性大豆分離蛋白可顯著改善肌原纖維蛋白凝膠體系的凝膠強(qiáng)度、保水性及流變特性。杜洪振等[9]研究預(yù)熱處理大豆蛋白以不同比例加入到肌原纖維蛋白中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過處理的大豆蛋白與MP混合凝膠的凝膠硬度、彈性和持水性顯著高于天然大豆蛋白與MP形成的混合凝膠。

試驗(yàn)從花生粕中提取花生分離蛋白，采用pH偏移法對(duì)其改性，對(duì)比研究添加改性和天然花生分離蛋白對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)、流變和保水等特性的影響，為花生分離蛋白在肉制品加工中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂花生粕（河南駐馬店盛豐糧油有限公司）；大豆油、豬肉（市售）；牛血清蛋白（BSA，索萊寶公司）；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)（DELTA 320，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；流變儀（Discovery，美國(guó)TA儀器公司）；低場(chǎng)核磁共振成像分析儀（NM120，上海紐邁電子科技有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（TGL-20KR，上海安亭科學(xué)儀器廠）；質(zhì)構(gòu)分析儀（TA.XT. Plus，英國(guó)Stable Micro System公司）；高速均質(zhì)機(jī)（T25，德國(guó)IKA公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生分離蛋白（PPI）的制備

根據(jù)Ji等[10]的方法。脫脂花生粕經(jīng)粉碎干燥，按料液比1∶10（g/mL）與去離子水混合，調(diào)節(jié)至pH 9.0，磁力攪拌2 h，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，調(diào)節(jié)至pH 4.5，以4 000 r/min離心15 min，得到沉淀，用去離子水洗滌沉淀2次，調(diào)節(jié)至pH 7.0，透析除去鹽離子，冷凍干燥后備用。凱氏定氮法測(cè)定PPI含量98.4g/100 g。

1.3.2 pH偏移處理PPI

將冷凍干燥后的PPI粉末溶解于去離子水中（質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%），磁力攪拌30 min，充分混勻。用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)PPI溶液至pH 10.0，立即將其放入40℃水浴鍋中水浴加熱，保持1 h后，取出立即冷卻，將PPI溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0。冷凍干燥備用。將改性后的花生分離蛋白命名為AH-PPI，天然的花生分離蛋白為N-PPI。

1.3.3 豬肉肌原纖維蛋白（MP）的提取

參考劉旺等[11]的方法。將豬里脊肉絞碎后加入4倍體積提取液（4 ℃，0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，10 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 7.0），在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下混勻，每次20 s，勻漿3次。在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟3次。加入4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液洗滌蛋白，以相同的離心條件離心，棄去上清液，重復(fù)3次，過3層紗布，得到純凈的豬肉肌原纖維蛋白，在4 ℃下儲(chǔ)存，48 h內(nèi)使用完畢。蛋白濃度測(cè)定方法采用雙縮脲法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.4 改性PPI-MP混合凝膠的制備

豬肉肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度調(diào)整為30 mg/mL，分別加入0.25%，0.50%和0.75%的改性PPI，在10 000r/min下60 s混勻，以800 r/min離心5 min，混合蛋白在恒溫水浴鍋中從20 ℃加熱至80 ℃并保持30 min，于4℃冰箱儲(chǔ)存，48 h內(nèi)使用完畢。

1.3.5 凝膠質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

參考Chen等[12]的方法并略有修改。使用P0.5探頭，測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度分別為1.0，1.0和2.0 mm/s，應(yīng)變40%，觸發(fā)力5 g。測(cè)定后得到一條曲線，第1個(gè)峰頂點(diǎn)為樣品破裂點(diǎn)，定義為樣品的凝膠強(qiáng)度（g），重復(fù)6次。

1.3.6 凝膠保水性（WHC）的測(cè)定

精確稱取6 g蛋白凝膠于10 mL離心管中，在8 000r/min速度下離心10 min，在濾紙上倒置20 min除去多余水分，記錄離心前后離心管和樣品質(zhì)量。保水性按式（1）計(jì)算。

式中：W2為離心后凝膠和離心管總質(zhì)量，g；W1為離心前凝膠和離心管總質(zhì)量，g；W0為離心管質(zhì)量，g。

1.3.7 流變特性的測(cè)定

參照Kang等[13]的方法略有改動(dòng)。用40 mm平板，甲基硅油密封，間隙0.6 mm，應(yīng)變?yōu)?.05%，于25～90℃線性升溫，速率1 ℃/min，頻率1 Hz。測(cè)定流變儲(chǔ)能模量G’。

1.3.8 凝膠水分分布的測(cè)定

參考Han等[14]的方法，用NM120低場(chǎng)核磁共振成像分析儀測(cè)量混合凝膠的弛豫時(shí)間（T2）。參數(shù)設(shè)定：溫度32.00±0.01 ℃；頻率18 MHz；掃描16次；回聲數(shù)12 000；重復(fù)時(shí)間間隔100 ms；半回波時(shí)間τ-值200 μs。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5軟件繪圖，采用SPSS軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和最小顯著差異法Ducan檢驗(yàn)（p＜0.05），數(shù)據(jù)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)除標(biāo)明外，均重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加花生分離蛋白對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

如圖1所示，加入0.25%和0.50%天然花生分離蛋白（N-PPI）時(shí)，肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度無顯著變化，添加0.75% N-PPI時(shí)，肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度顯著下降（p＜0.05）且降低10.24%。同時(shí)，肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度隨著N-PPI濃度升高而逐漸降低，這與Niu等[8]將大豆蛋白添加至肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的結(jié)果相似。

添加AH-PPI可顯著提高M(jìn)P的凝膠強(qiáng)度（p＜0.05）。與MP相比，AH-PPI濃度在0.25%～0.75%時(shí)，混合凝膠的凝膠強(qiáng)度增加12.96%～21.07%。這可能是因?yàn)閴A性pH處理導(dǎo)致PPI球狀結(jié)構(gòu)展開，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露，增強(qiáng)PPI與MP之間的分子相互作用，形成更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)MP的凝膠強(qiáng)度。

圖1 添加花生分離蛋白對(duì)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

2.2 花生分離蛋白添加量對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

圖2 添加花生分離蛋白對(duì)肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

如圖2所示，N-PPI添加量0.25%和0.50%時(shí)，MP凝膠的保水性無顯著性變化（p＞0.05），添加量達(dá)到0.75%時(shí)，MP凝膠的保水性顯著降低。這可能是因?yàn)镹-PPI較大添加量時(shí)可能會(huì)部分破壞凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致保水性下降。

然而，添加AH-PPI時(shí)，MP凝膠保水性顯著增加（p＜0.05），說明AH-PPI/MP混合凝膠形成的凝膠對(duì)水的束縛力更強(qiáng)。Westphalen等[15]發(fā)現(xiàn)WHC的增加部分可能是因?yàn)榈鞍啄z內(nèi)氫鍵的增加。因此，可能是由于AH-PPI側(cè)鏈基團(tuán)的暴露促進(jìn)MP和PPI分子間的相互作用，從而形成更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將更多的水束縛其中，提高凝膠保水性。

2.3 添加花生分離蛋白對(duì)豬肉肌原纖維蛋白流變特性的影響

圖3 添加花生分離蛋白對(duì)肌原纖維蛋白流變特性的影響

花生分離蛋白添加量對(duì)豬肉肌原纖維蛋白的流變特性儲(chǔ)能模量G’的影響如圖3所示。儲(chǔ)能模量G’反映肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的大小[16-17]。圖3顯示花生分離蛋白添加對(duì)MP從25～90 ℃加熱過程中儲(chǔ)能模量（G’）的變化。添加PPI的MP混合凝膠G’整體趨勢(shì)相同，都有4個(gè)溫度范圍：在25～40 ℃，G’基本保持不變；在40～50 ℃，G’迅速升高，這是弱凝膠網(wǎng)絡(luò)開始形成階段，此時(shí)肌球蛋白頭部相互交聯(lián)，形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[18]；在50～60 ℃，G’逐漸下降，這是因?yàn)榧∏虻鞍孜膊块_始變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重組，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞[19-20]，此時(shí)是凝膠減弱階段；在60～90 ℃，G’隨著溫度升高而迅速升高，此時(shí)是凝膠加強(qiáng)階段，說明凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成[21]。

如圖3（A）所示，在加熱過程中，添加N-PPI的G’值均低于MP對(duì)照組，并隨著N-PPI添加量增加，MP凝膠體系的儲(chǔ)能模量G’均下降，但除添加0.75%N-PPI，其他均無顯著性變化，說明N-PPI與MP不發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，因此對(duì)MP的膠凝作用不明顯。Ramíezsuaez等[22]報(bào)道完整的外源蛋白具有較致密的結(jié)構(gòu)，可能不利于肌肉蛋白凝膠化。如圖3（B）所示，添加AH-PPI的G’值均高于MP對(duì)照組，并隨著AH-PPI添加量增加，MP凝膠體系的G’顯著上升，說明添加AHPPI的MP凝膠的強(qiáng)度更好，更有利于MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，更有利于豬肉制品的加工品質(zhì)。這一現(xiàn)象可能是由于AH-PPI中活性基團(tuán)促進(jìn)PPI與MP之間的相互作用，因此凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加致密堅(jiān)固。Liu等[23]報(bào)道了經(jīng)過酸和熱處理的大豆分離蛋白，會(huì)處于熔融球狀態(tài)，暴露出更多內(nèi)部的活性基團(tuán)，蛋白鏈部分展開。這種柔性結(jié)構(gòu)會(huì)有利于MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。

2.4 添加花生分離蛋白對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠水分分布的影響

利用LF-NMR測(cè)定肌原纖維蛋白凝膠的水分分布，MP凝膠的T2弛豫時(shí)間一般會(huì)出現(xiàn)3～4個(gè)峰，每個(gè)峰代表不同的水分狀態(tài)[24-26]。如圖4所示，MP及混合凝膠的T2弛豫時(shí)間分布出現(xiàn)4個(gè)峰，T2弛豫時(shí)間峰0.1～1 ms時(shí)，代表與蛋白質(zhì)大分子結(jié)合最為緊密的結(jié)合水，用T2b表示；T2弛豫時(shí)間峰1～100 ms時(shí)，代表與大分子結(jié)合程度較弱的不易流動(dòng)水，用T21表示；T2弛豫時(shí)間峰100～1 000 ms時(shí)，代表是毛細(xì)管里等原因留存在凝膠結(jié)構(gòu)中的中度可移動(dòng)水，用T22表示；T21和T22都可稱為不易流動(dòng)水；1 000 ms后，代表可自由移動(dòng)的自由水，用T23表示。如圖4所示，所有樣品均出現(xiàn)4個(gè)峰，說明肌原纖維蛋白凝膠中主要存在4種狀態(tài)的水。由表1可知，MP凝膠體系中4個(gè)T2弛豫時(shí)間峰面積比例中，PT22數(shù)值最高，說明在MP凝膠體系中絕大部分水為中度可移動(dòng)水。

圖4 添加花生分離蛋白對(duì)肌原纖維蛋白凝膠水分分布的影響

從表1中看出，隨著AH-PPI添加量增加，PT23自由水的峰面積百分?jǐn)?shù)顯著降低，而不易流動(dòng)水PT21+PT22峰面積百分比顯著增加，說明在熱誘導(dǎo)形成凝膠的過程中，自由水向不易流動(dòng)水移動(dòng)。據(jù)報(bào)道，T2b對(duì)物理特性和WHC的影響可忽略不計(jì)，而T21和T22的峰比例之和與WHC有顯著正相關(guān)[27]。這與上述WHC的結(jié)果基本一致。因此，相對(duì)于N-PPI的添加，AH-PPI可更好維持豬肉肌原纖維蛋白凝膠的保水能力。

表1 添加花生分離蛋白對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠各弛豫峰峰面積百分?jǐn)?shù)的影響

3 結(jié)論

添加天然花生分離蛋白不能改善豬肉肌原纖維蛋白的凝膠特性，然而添加改性花生分離蛋白（AHPPI）可有效改善豬肉MP凝膠體系的凝膠強(qiáng)度、保水性能和流變特性。低場(chǎng)核磁分析顯示凝膠體系主要包含4種狀態(tài)的水，且添加AH-PPI的凝膠體系不易流動(dòng)水峰比例升高，T23自由水比例下降。試驗(yàn)表明，花生分離蛋白經(jīng)pH偏移改性后，能顯著改善豬肉肌原纖維蛋白的凝膠性能，為拓展其在肉制品加工中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。