張偉，董紅敬，劉偉，王曉，劉峰*

齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測試中心（濟(jì)南 250014）

金銀花是藥食同源的食物，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱的功效[1]，還具有保肝利膽、提高免疫力等作用[2]。綠原酸是金銀花質(zhì)量控制的標(biāo)志化合物[1]，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗菌、抗腫瘤、抗炎等活性[3-6]，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸縮合生成的縮酚酸，是一種高極性的天然化合物，易溶于甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑[7]，易氧化，同分異構(gòu)體較多，分離純化難度較大。目前綠原酸的制備工藝主要采用大孔樹脂預(yù)純化，制備液相[8]、聚酰胺層析精制[9]等方法。但這些方法對樣品的吸附作用是不可逆的，對溶劑的要求較高。

高速逆流色譜（HSCCC）是一種液-液分配色譜，能有效避免樣品分離時(shí)出現(xiàn)不可逆吸附、變性失活等情況，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離中[10-14]。采用HSCCC分離高極性化合物，通常使用正丁醇-水為基礎(chǔ)的溶劑系統(tǒng)，這類系統(tǒng)在逆流色譜柱中固相保留率較小，且容易流失，影響分離效果。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，用V（正丁醇）∶V（甲酸）∶V（水）=4∶1∶5溶劑系統(tǒng)經(jīng)2次高速逆流色譜分離得到94.8%綠原酸，但該溶劑系統(tǒng)保留值較低，分離效率差。離子液體是一類在室溫或接近室溫下呈液體的鹽類，具有穩(wěn)定性好、揮發(fā)性弱、不易燃易爆、溶解度大、可重復(fù)利用等特點(diǎn)[16]。咪唑類離子液體可與含有羥基和羧基的有機(jī)酸分子形成氫鍵等作用力[17]。因此，在高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)中，加入咪唑類離子液體可以使有機(jī)酸分布在有機(jī)相中，增大有機(jī)酸在上相中的分配，從而實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸的分離。

此次試驗(yàn)擬考察離子液體[C6min][PF6]（結(jié)構(gòu)式見圖1A）對綠原酸在乙酸乙酯-水兩相溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的影響，從金銀花中分離制備綠原酸（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1B），以期為HSCCC分離高極性天然活性物質(zhì)提供新的理論支持。

圖1 [C6min][PF6]和綠原酸的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥材購于當(dāng)?shù)厮幍?，?jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾。乙酸乙酯、乙醇（均為分析純，天津廣成化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（分析純，山東宏仕德化工有限公司）；[C6min][PF6]（分析純，上海成捷化學(xué)有限公司）；乙腈（色譜純，山東禹王試劑有限公司）；水（高純水）。

1.2 儀器與設(shè)備

GS10A高速逆流色譜儀（北京新技術(shù)研究所）；S系列柱塞式泵（北京圣益通技術(shù)開發(fā)有限公司）；8823B型紫外檢測儀（北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司）；Waters 600高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Varian INOVA-600核磁共振波普儀（美國Varian公司）；Agilent 5973N質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）。

1.3 綠原酸粗提物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[18]方法，略作修改。取1.0 kg金銀花，粉碎后，用95%乙醇回流提取3次，時(shí)間分別為2，2和1 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃濃縮。由于提取物中會有大量的黃酮類化合物，根據(jù)綠原酸與黃酮類化合物的極性差距，黃酮類化合物在乙酸乙酯中的溶解度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于綠原酸在乙酸乙酯中的溶解度。將濃縮液用蒸餾水稀釋至1 000 mL，用乙酸乙酯萃取2次（萃取體積比為1∶1），去除提取物中黃酮等化合物。再向水溶液中加濃HCl調(diào)pH至3.0～4.0，然后用乙酸乙酯萃取，此時(shí)綠原酸主要集中在乙酸乙酯相中[18]，濃縮乙酸乙酯萃取物后得20.5 g綠原酸粗提物，放置于冰箱內(nèi)冷藏，待用。

1.4 溶劑系統(tǒng)的選擇

以V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5為基礎(chǔ)溶劑系統(tǒng)，向此溶劑系統(tǒng)中加入不同比例的[C6min][PF6]，混勻，平衡。取2 mg綠原酸粗提物置于試管中，分別加入2 mL上下相，超聲，待樣品完全溶解后，用高效液相色譜法測定樣品在上下相的濃度，上相峰面積與下相中的峰面積之比即為綠原酸在該溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)KD。

1.5 兩相溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的配制

溶劑系統(tǒng)為V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5，按比例置于分液漏斗中，充分振蕩，靜置12 h，分取上下相，待用。將樣品用上相和下相各3 mL溶解，待用。

1.6 高速逆流色譜分離

按所選溶劑系統(tǒng)，以一定比例在分液漏斗中混勻、靜置12 h，用前將上下相分開。首先以9.0 mL/min的流速將上相泵入色譜柱，待色譜柱注滿后，開啟速度控制器，轉(zhuǎn)速調(diào)為800 r/min，然后用1.0 mL/min的流速泵入下相，待系統(tǒng)平衡好后，開啟六通閥，將溶有樣品的上下相混合液注入柱色譜。打開檢測器，在254 nm下檢測流出組分。收集色譜峰組分，用HPLC分析樣品純度。

1.7 色譜條件

采用Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m），流動相為乙腈-水（0.2% HCOOH）。洗脫梯度：0～15 min，10%乙腈；16～35 min，10%→100%乙腈；36～40 min，100%乙腈。流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑系統(tǒng)的選擇

目標(biāo)化合物在逆流色譜兩相體系中的分配系數(shù)（KD）是篩選高速逆流色譜溶劑分離系統(tǒng)的關(guān)鍵，其最佳KD值范圍在0.5～2.0之間[19]。通過向V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5的溶劑系統(tǒng)中加入不同比例的[C6min][PF6]，綠原酸在上下相中的分配系數(shù)會發(fā)生改變，表1是不同添加量的[C6min][PF6]離子液體對綠原酸分配系數(shù)的影響。在V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5的溶劑體系中綠原酸的KD值為0.32，采用此兩相溶劑系統(tǒng)對樣品進(jìn)行分離，高速逆流色譜圖及HPLC分析如圖2所示。采用此溶劑系統(tǒng)，固定相保留率為35%，綠原酸峰（圖2A陰影部分）與其它色譜峰分離度較差，不能分離得到綠原酸純品（圖2B）。從表1可以看出，綠原酸在V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5和V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.8 2個(gè)兩相溶劑系統(tǒng)中的KD值分別為0.70和0.77，KD值較為理想。

表1 綠原酸在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)

圖2 金銀花浸膏乙酸乙酯/水體系高速逆流色譜圖

2.2 HSCCC分離結(jié)果

考慮到試驗(yàn)成本因素，首先選用V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5為兩相溶劑系統(tǒng)，采用1.6小節(jié)的方法，從金銀花粗提物中分離得到高純度綠原酸，體系固定相保留率為45%，高速逆流圖如圖3A（陰影部分為綠原酸）所示。經(jīng)HPLC分析（圖3B），其純度為97.5%。V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5為最佳兩相溶劑系統(tǒng)。

離子液體在水相中有一定的溶解度并且在溶液中不易除去，大孔樹脂HPD-100對高極性化合物[C6min][PF6]的吸附能力很差，對綠原酸有一定的吸附性，試驗(yàn)將HSCCC流出液經(jīng)大孔樹脂HPD-100精制，20%乙醇洗脫，去除綠原酸中的[C6min][PF6]，然后用90%的乙醇洗脫，可得到綠原酸純品。經(jīng)過上述過程，300 mg的金銀花粗提物可得到30 mg的高純度綠原酸。

2.3 [C6min][PF6]改變?nèi)軇┫到y(tǒng)分配系數(shù)機(jī)制探討

單獨(dú)測定綠原酸及將10 mg [C6min][PF6]放入含有5 mg綠原酸的核磁共振管中，通過1H NMR的研究，根據(jù)綠原酸分子鏈上各質(zhì)子化學(xué)位移的變化，即可推斷出綠原酸與[C6min][PF6]的作用位置。結(jié)果顯示，綠原酸中羧基H信號消失，而苯環(huán)上的3′-OH和4′-OH化學(xué)位移較大，分別為0.022和0.026×10-6（如表2所示）。這說明當(dāng)含有[C6min][PF6]溶劑系統(tǒng)中存在綠原酸時(shí)，羧基的氧原子與[C6min][PF6]中的咪唑環(huán)之間存在靜電力；同時(shí)，苯環(huán)上的羥基氫原子與離子液體的陰離子之間存在氫鍵作用力。這兩種力量相互作用有利于有機(jī)酸從水相中進(jìn)入離子液體相（有機(jī)相），向V（乙酸乙酯）∶V（水）=1∶1兩相溶劑系統(tǒng)中加入不同比例的[C6min][PF6]，可改善綠原酸在兩相溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)，從而促進(jìn)化合物的分離。

圖3 金銀花浸膏乙酸乙酯/水/[C6min][PF6]體系高速逆流色譜圖

表2 綠原酸及綠原酸與[C6min][PF6]混合后1H NMR化學(xué)位移

2.4 化合物的確定

峰Ⅰ：白色粉末，ESI-MSm/z377[M+Na]+；1H NMR（DMSO，600 MHz）δ：1.74（2H，m，H-2），5.05（1H，dt，J=8.4，3.6 Hz，H-3），3.55（1H，m，H-4），3.92（1H，m，H-5），1.97（2H，m，H-6），7.01（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），6.72（1H，d，J=7.2 Hz，H-5′），6.96（1H，dd，J=7.2，1.8 Hz，H-6′），7.42（1H，d，J=16.8 Hz，H-7′），6.13（1H，d，J=16.8 Hz，H-8′），與文獻(xiàn)[20]對照，確定為綠原酸。

3 結(jié)論

以乙酸乙酯-水為基礎(chǔ)系統(tǒng)，向溶劑系統(tǒng)中添加離子液體[C6min][PF6]，改善了綠原酸在兩相溶劑系統(tǒng)中的分配，并通過1H NMR闡述了其作用機(jī)制。通過此研究，可以證實(shí)離子液體能改善高極性化合物在逆流色譜的溶劑系統(tǒng)的分配，從而實(shí)現(xiàn)高極性化合物的分離，這拓寬了HSCCC分離天然產(chǎn)物的應(yīng)用范圍。