檀美娟，張宇臣，陳小娥，袁高峰*

浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院（舟山 316022）

共軛脂肪酸是對(duì)具有共軛雙鍵體系的多不飽和脂肪酸位置和立體異構(gòu)體的通稱[1]。共軛脂肪酸可以是雙烯、三烯、四烯形式，最常見的共軛脂肪酸是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，也就是共軛亞油酸（CLA）和共軛亞麻酸（CLNA）。CLNA自然存在于植物的種子中，天然資源非常豐富，由于雙鍵的位置和構(gòu)型不同有不同的異構(gòu)體，石榴酸是其中研究最為廣泛的異構(gòu)體之一[2]。石榴酸是9，11，13位雙鍵共軛，與9，11-CLA具有共同的9，11位共軛結(jié)構(gòu)，與亞麻酸一樣是補(bǔ)充人體缺乏ω-3系列不飽和脂肪酸的理想成分[3]，主要存在于石榴籽和栝樓籽中，其含量分別占75%和35%[4-5]，因其主要來源于石榴而得名[6]。近年來，各種體外、動(dòng)物和人體試驗(yàn)均表明，石榴酸等共軛亞麻酸具有抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、抗氧化和抗炎等的功能[7-12]，這引起了學(xué)者廣泛的研究興趣[13-14]。研究表明，石榴酸能在大鼠血漿和組織器官中及體外培養(yǎng)的細(xì)胞中吸收分布[15-17]，通過人體試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，石榴酸能整合到人體血漿中[18]。為研究石榴酸生理功能及把石榴酸作為功能因子推廣應(yīng)用，有必要對(duì)石榴酸分離純化工藝進(jìn)行研究。

低溫結(jié)晶法是常用的分離純化多不飽和脂肪酸的方法。低溫結(jié)晶法利用飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸凝固點(diǎn)上的差異使兩者分離，將混合脂肪酸溶于有機(jī)溶劑，在低溫環(huán)境中靜置使其析出結(jié)晶，并迅速分離出晶體，從而達(dá)到飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分離的目的[19]。低溫下可使不飽和脂肪酸結(jié)晶的更為充分，收率較高，生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單，成本較低，且低溫下多不飽和脂肪酸不易發(fā)生氧化，是提純多不飽和脂肪酸的有效方法。試驗(yàn)以低溫溶劑結(jié)晶法對(duì)石榴酸的分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期制備高純度石榴酸。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

石油醚（沸程60～90 ℃）、正己烷、95%乙醇、無水乙醇、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、NaCl、無水硫酸鈉、甲苯、硫酸、甲醇、甲醇鈉、乙腈、丙酮（均為分析純）。

1.2 試驗(yàn)主要設(shè)備

安捷倫7890B氣相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；A-1000s旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；sk5210HP超聲波清洗機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；85-1恒溫磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；LXJ-ⅡB低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；EL-303電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）儀器有限公司）；DFT-250手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；超低溫冰箱（杭州寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司）；美的-BCD-246-CMA冰箱（合肥美的榮事達(dá)冰箱有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴籽油制備

石榴籽烘干去除雜物，高速粉碎機(jī)打成粉末，過80目篩，用石油醚做溶劑，40 ℃溫度下，超聲1 h后保溫過夜，采用布氏漏斗過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到石榴籽油[20]，加BHT存儲(chǔ)于冰箱上層待用[19]。

1.3.2 石榴籽油脂肪酸組成分析

脂肪酸采用酸法甲酯化[21]。取少量晶體于玻璃離心管中，加入1 mL甲苯和2 mL 0.5 mol/L硫酸甲醇溶液，往離心管中加入2滴50 mg/L BHT溶液，蓋好蓋子，充分振蕩，于55 ℃皂化反應(yīng)20 min（不時(shí)振蕩），甲酯化反應(yīng)后冷卻到室溫。加入1 mL飽和鹽水和2 mL正己烷，充分振蕩，以1 500 r/m離心10 min。取上層液于1支裝有2 mL蒸餾水的干凈試管中，振搖，靜置。取上層液于一加有無水硫酸鈉的玻璃管中，搖勻，將液體小心轉(zhuǎn)移到干凈樣品瓶中。

色譜條件：色譜柱HP-INNOWAX（60 m×0.320mm，0.5 μm）；程序升溫為200 ℃恒溫保持 2 min，以 20 ℃/min升溫至240 ℃后恒溫保持30 min，以20 ℃/min升溫至250 ℃，恒溫10 min。載氣為氮?dú)猓捎梅至鞣绞竭M(jìn)樣，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度270 ℃，進(jìn)樣口溫度270 ℃。

1.3.3 石榴籽油皂化反應(yīng)

用80 mL水溶解24 g NaOH和0.5 g乙二胺四乙酸二鈉，在溶液中加入80 mL無水乙醇得到NaOH溶液[23]。取25 g石榴籽油，加入NaOH溶液80 mL，40 ℃條件下磁攪拌40 min，加入20 mL水和90 mL正己烷，繼續(xù)攪拌80 min，除去不皂化物的上層，下層加入40 mL水，加入12 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 1，反應(yīng)片刻分層后用分液漏斗除去下層，用無水硫酸鎂干燥上層溶液后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到脂肪酸。

1.3.4 脂肪酸結(jié)晶單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)

以結(jié)晶溶劑、結(jié)晶時(shí)間、結(jié)晶溫度和料液比為試驗(yàn)因子，根據(jù)雍梁敏等[22]采用冷凍結(jié)晶法分離橡膠籽油中多不飽和脂肪酸及Ju等[23]對(duì)高純度γ-亞麻酸研究，采用正己烷、丙酮、乙腈、丙酮+乙腈（2∶1）作為結(jié)晶溶劑。選用結(jié)晶時(shí)間24 h、結(jié)晶溫度-20℃，料液比1∶6（g/mL），探究正己烷、丙酮、乙腈、丙酮+乙腈（2∶1）中最佳結(jié)晶溶劑；結(jié)晶時(shí)間24 h，料液比1∶6（g/mL），用丙酮+乙腈（2∶1）溶解條件下，探究-80，-60，-40，-20和0 ℃中的最佳溫度；丙酮+乙腈（2∶1）溶解，結(jié)晶溫度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL），探究12，18，24，30和36 h中的最佳結(jié)晶時(shí)間；丙酮+乙腈（2∶1）溶解，結(jié)晶溫度-20 ℃，結(jié)晶時(shí)間24 h，探究1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8（g/mL）中的最佳料液比，以回收率和石榴酸純度為考察指標(biāo)，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行組。石榴酸純度以石榴酸占石榴籽油總脂肪酸百分含量計(jì)算。

用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。以結(jié)晶溫度、料液比和結(jié)晶時(shí)間為因素，回收率、石榴酸純度為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)安排見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼值表

1.3.5 重結(jié)晶試驗(yàn)

在最佳工藝條件下，按照試驗(yàn)方法一次結(jié)晶后，將分離得到的晶體二次溶解進(jìn)行重結(jié)晶，進(jìn)行同樣分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次平均值，數(shù)據(jù)采用Origin Pro 9.1 32Bit分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溶劑種類對(duì)脂肪酸結(jié)晶的影響

不同溶劑溶解結(jié)晶試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。以丙酮為溶劑時(shí)回收率和不飽和脂肪酸純度最低，且丙酮為溶劑時(shí)結(jié)晶回收較困難，極易溶解，而丙酮乙腈（2∶1）混合時(shí)回收率和純度效果明顯提高，可能是因?yàn)橐译婺厅c(diǎn)高于丙酮，低溫下，乙腈會(huì)凝固，更有利于溶液中脂肪酸結(jié)晶。正己烷的石榴酸純度雖然很高，但回收率很低，使用乙腈時(shí)結(jié)晶效果次于乙腈丙酮混合溶液，因此最理想的結(jié)晶溶劑為乙腈丙酮（2∶1）混合溶液。

2.1.2 溫度對(duì)脂肪酸結(jié)晶的影響

圖1 溶劑種類對(duì)結(jié)晶的影響

不同溫度對(duì)脂肪酸結(jié)晶影響結(jié)果如圖2所示。隨著結(jié)晶溫度升高，脂肪酸結(jié)晶回收率逐漸下降，石榴酸純度先升高后下降，可能由于溫度急劇降低，結(jié)晶中會(huì)包含母液，影響回收晶體質(zhì)量，過低溫度下，體系中會(huì)形成很多晶核，且易形成細(xì)軟不穩(wěn)定的晶體，使整個(gè)體系粘度增加，妨礙分子移動(dòng)，從而影響結(jié)晶效果[24]。溫度-20 ℃時(shí)，石榴酸純度達(dá)到90.5%，溫度繼續(xù)升高，0 ℃時(shí)，結(jié)晶效果急劇下降，因?yàn)檩^高溫度下，脂肪酸的溶解度較高，難以結(jié)晶。因此，在試驗(yàn)結(jié)晶溫度范圍內(nèi)，考慮耗能因素，選擇最佳結(jié)晶溫度為-20 ℃。

圖2 溫度對(duì)脂肪酸結(jié)晶的影響

2.1.3 時(shí)間對(duì)脂肪酸結(jié)晶的影響

不同時(shí)間對(duì)脂肪酸結(jié)晶影響結(jié)果如圖3所示。隨著時(shí)間增加，石榴酸純度逐漸增加，24 h達(dá)到89.6%，時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，石榴酸純度反而下降，可能是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，體系中其他脂肪酸結(jié)晶含量增加，導(dǎo)致石榴酸含量下降；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，脂肪酸結(jié)晶回收率不斷增加，考慮結(jié)晶時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)增加其他脂肪酸結(jié)晶，而且長(zhǎng)時(shí)間處于低溫下，會(huì)導(dǎo)致體系黏度增大，會(huì)有更多的濾液夾帶在晶體中，影響晶體實(shí)際質(zhì)量[25]，因此最佳結(jié)晶時(shí)間選取24 h。

圖3 時(shí)間對(duì)脂肪酸結(jié)晶的影響

2.1.4 料液比對(duì)脂肪酸結(jié)晶的影響

由圖4可知，隨著料液比增加，石榴酸純度先增加后減少，但是變化幅度不大；隨著料液比增加，回收率下降，可能是因?yàn)殡S著料液比增加，結(jié)晶溫度要求相應(yīng)降低[26]，考慮溶劑回收和溫度要求，選擇最佳料液比為1∶6（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)脂肪酸結(jié)晶的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

利用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到三元二次回歸方程：R1=89.14-26.12A-8.58B+11.56C+2.16AB-2.11AC+4.23BC-30.27A2-14.72B2-10.45C2；R2=93.91-13.22A+0.61B+2.08C+1.12AB-1.17AC-2.89BC-16.39A2-2.89B2-5.12C2。

對(duì)模型進(jìn)行顯著性方差分析，分析結(jié)果見表3。方程一次項(xiàng)A（結(jié)晶溫度）、B（料液比）和C（結(jié)晶時(shí)間）對(duì)響應(yīng)值R1（回收率）的影響均為極顯著，A、C對(duì)R2（石榴酸純度）的影響為極顯著，各因素對(duì)R1、R2影響程度的主次順序均為A＞C＞B，其中結(jié)晶溫度影響最大。

回歸方程二次項(xiàng)A2、B2、C2，對(duì)響應(yīng)值R1、R2的影響均為極顯著（p＜0.01）；交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)R1的影響均為極顯著（p＜0.01），交互項(xiàng)BC對(duì)R1、R2的影響均為極顯著（p＜0.01），而交互項(xiàng)AB、AC對(duì)R1、R2的影響為顯著（p＜0.05）。2個(gè)回歸方程模型失擬項(xiàng)p值均大于0.05，即失擬不顯著，表明方程擬合度好，誤差小，可根據(jù)該方程對(duì)不同處理?xiàng)l件下的結(jié)晶回收率和石榴酸純度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；CV1=1.65%，CV2=0.80%，變異系數(shù)值越小，表明方程越可靠。所以，回歸方程模型能夠較好反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，利用回歸方程可以得到優(yōu)化結(jié)晶回收率和石榴酸純度的最優(yōu)工藝條件。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

2.2.2 各因素交互作用及預(yù)測(cè)結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)得到多元回歸方程，分別建立各試驗(yàn)因素與結(jié)晶回收率和石榴酸純度的三維曲面圖，確定最佳工藝，如圖5和圖6所示。

由圖5可知，料液比、結(jié)晶溫度及結(jié)晶時(shí)間的交互作用對(duì)結(jié)晶回收率的影響極顯著（p＜0.01）圖中曲面陡峭。由圖6可知，料液比和結(jié)晶溫度及結(jié)晶時(shí)間和結(jié)晶溫度的交互作用對(duì)石榴酸純度的影響為極顯著（p＜0.01），曲面陡峭，而料液比與結(jié)晶溫度的交互作用對(duì)石榴酸純度的影響顯著（p＜0.05），曲面比較陡峭，這與表3方差分析結(jié)果一致。

通過回歸模型分析，以結(jié)晶回收率為響應(yīng)值的最佳工藝條件為結(jié)晶溫度-18.06 ℃，料液比1∶5.62（g/mL），結(jié)晶時(shí)間26.2 h，在此工藝條件下，模型預(yù)測(cè)結(jié)晶回收率89.8%。以石榴酸純度為響應(yīng)值的最佳工藝條件為：結(jié)晶溫度-18.04 ℃、料液比1∶5.56（g/mL）、結(jié)晶時(shí)間26.2 h，在此工藝條件下，模型預(yù)測(cè)石榴酸純度92.5%。綜合考慮優(yōu)化結(jié)果，結(jié)合實(shí)際操作條件，選擇結(jié)晶溫度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL），結(jié)晶時(shí)間26 h，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到結(jié)晶回收率90.3%，石榴酸純度93.7%。

圖5 各試驗(yàn)因素交互作用對(duì)結(jié)晶回收率影響的響應(yīng)面及等高線

圖6 各試驗(yàn)因素交互作用對(duì)石榴酸純度的響應(yīng)面及等高線

2.3 重結(jié)晶試驗(yàn)結(jié)果

在響應(yīng)優(yōu)化的最佳條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，一次結(jié)晶的基礎(chǔ)上將得到的結(jié)晶在最佳工藝條件下再次溶于新的溶劑中進(jìn)行二次結(jié)晶，結(jié)果取3組試驗(yàn)平均值。石榴酸純度由92.7%提高到97.2%。

2.4 純化前后石榴籽油中脂肪酸相對(duì)含量變化

為了解純化前后石榴籽油中脂肪酸相對(duì)含量的變化，通過氣相色譜分析得純化前后脂肪酸色譜圖，結(jié)果如圖7所示，純化石榴酸百分含量72.9%，經(jīng)過純化后提高到97.2%。經(jīng)2步純化后石榴籽油中大部分飽和脂肪酸被除去，石榴酸純度顯著提高。

圖7 石榴籽油純化前和純化后氣相色譜圖

3 結(jié)論

以低溫溶劑結(jié)晶法對(duì)石榴酸的分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期制備高純度石榴酸。低溫結(jié)晶法能有效分離純化石榴酸等共軛多不飽和脂肪酸，低溫結(jié)晶分離石榴酸最佳工藝條件為溶劑為丙酮和乙腈2∶1混合溶液，結(jié)晶時(shí)間26 h，結(jié)晶溫度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL）。最佳工藝條件下，得到結(jié)晶回收率90.3%，石榴酸純度93.7%，通過二次結(jié)晶可將石榴酸純度提高到97.3%。低溫溶劑結(jié)晶法生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單，成本較低，低溫下避免石榴酸等共軛多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，可作為制備高純度石榴酸的有效方法。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探究石榴酸生理功能及把石榴酸作為功能因子推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。