陳勝利，郝華芳，季文恒，儲岳峰

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046)

支原體(Mycoplasma)屬于原核生物界柔膜體綱支原體科，普遍存在于自然界，有200多個種，其中動物支原體多達幾十種[1]。獸醫(yī)上最重要的支原體有絲狀支原體絲狀亞種(牛傳染性胸膜肺炎-牛肺疫病原)、豬肺炎支原體(豬地方性肺炎病原)、山羊支原體山羊肺炎亞種(山羊傳染性胸膜肺炎病原)、雞毒支原體等[2]，此外，牛支原體、滑液支原體等對養(yǎng)殖業(yè)的危害日益嚴(yán)重，越來越受到重視。動物支原體感染主要表現(xiàn)為慢性、持續(xù)性，難以根治，已成為威脅養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要病原。

目前，動物支原體病的防控主要依賴疫苗和抗菌藥物，抗菌藥使用存在菌株耐藥性增加[3-7]、藥物殘留、病原很難被徹底清除等問題，臨床上應(yīng)用效果很不理想。疫苗是防控動物支原體病的重要手段，目前，主要為滅活疫苗和弱毒疫苗[8-10]。亞單位疫苗具有安全高效、成本低廉等優(yōu)點，是支原體病疫苗研發(fā)的一個重要發(fā)展方向。目前，已對多種支原體病亞單位疫苗進行研究，病原包括絲狀支原體絲狀亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.Mycoides，Mmm)、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)、牛支原體(Mycoplasmabovis，M.bovis)、雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)和山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp)等，但迄今未有商業(yè)化的動物支原體病亞單位疫苗。筆者對這幾種重要動物支原體病相關(guān)蛋白的免疫原性進行綜述，以期為動物支原體的免疫和疫苗研究提供參考。

1 絲狀支原體絲狀亞種

Mmm是牛傳染性胸膜肺炎病原，是最重要的動物支原體之一。Mmm免疫蛋白研究較為深入，部分免疫蛋白已試制亞單位疫苗，并進行了牛體免疫保護效果評價。應(yīng)用蛋白組學(xué)方法鑒定了Mmm一些免疫蛋白和毒力相關(guān)蛋白[11-12]，如H2O2產(chǎn)生和莢膜合成相關(guān)蛋白。L-α-甘油磷酸鹽氧化酶(GlpO)是支原體H2O2產(chǎn)生的重要酶，是Mmm重要的毒力因子和免疫蛋白，GlpO重組蛋白混合弗氏完全佐劑免疫牛，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，卻不能保護Mmm感染[13]?？缒ぶ鞍譒ppQ被認(rèn)為是Mmm的主要抗原和毒力因子，Mulongo等[14]用純化重組蛋白LppQ-N混合弗氏佐劑免疫牛，疫苗組表現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)化強陽性，但與對照組相比，臨床癥狀和大體病變評分無顯著差異，且在攻毒后腎小球腎炎增強，提示LppQ-N不適合作為亞單位疫苗抗原。對 Mmm 4種脂蛋白LppA、LppB、LppC 和LppQ的研究發(fā)現(xiàn)，雖然它們均能誘導(dǎo)體液免疫，但是體內(nèi)試驗顯示僅LppA能被淋巴細(xì)胞識別，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，表明LppA是CD4+T細(xì)胞抗原，可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，可作為潛在疫苗抗原[15]。莢膜多糖(CPS)是Mmm一種重要的毒力因子，CPS偶聯(lián)卵清蛋白免疫牛能誘導(dǎo)牛產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，能夠減輕病變，具有一定的免疫保護作用[16]。Perez-Casal等[17]通過反向疫苗學(xué)和基因組分析方法系統(tǒng)鑒定了66個潛在亞單位疫苗候選抗原，將這些蛋白表達后按其被牛傳染性胸膜肺炎陽性牛血清識別的能力強弱進行打分排序和分組，每組4～5個重組蛋白，配以CpG2007 ODN 和30% EmulsigenTM佐劑，制成疫苗免疫小牛，檢測發(fā)現(xiàn)在第35天各組針對每種蛋白的IgG1效價比免疫前顯著升高，且高于對照組，每種蛋白的IgG1滴度彼此之間無顯著差異；大多數(shù)蛋白可誘導(dǎo)IgG2和IgG1反應(yīng)，無免疫干擾；通過PBMC增殖試驗來檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)所有蛋白的抗原刺激指數(shù)與對照組之間無顯著差異，提示制備亞單位疫苗不能很好誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。攻毒保護試驗發(fā)現(xiàn) A組(MSC-0136+MSC-0957+MSC-0499+ MSC-0431+ MSC-0776，假定脂蛋白組)和C組(假定蛋白YP 004400559.1+假定蛋白YP 004399807.1 + Vsp+TE-Tu+脂蛋白MSC-0775)亞單位疫苗能夠提供保護，其中疫苗C組肺分離不到病原，N組(YP004400127.1+YP004399790.1+YP004400580.1+YP004400610.1)疫苗組可減輕病變，且肺病原分離陰性；其他重組蛋白疫苗組反而加重了病變；A組、C組和N組疫苗保護率分別為79.2%、83.0%和73.3%，結(jié)果表明，重組蛋白多組分亞單位疫苗可成功用于預(yù)防牛傳染性胸膜肺炎。研究提示，抗體介導(dǎo)的體液免疫在牛傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗免疫保護中發(fā)揮主要作用[18]。

2 牛支原體

國內(nèi)外研究者做了大量的工作，鑒定出多個牛支原體免疫蛋白，如GAPDH、PdhA、Tuf、P48、P81等。最近郭愛珍教授團隊通過基因組預(yù)測分析結(jié)合分泌蛋白組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)牛支原體HB0801株有60個 分泌蛋白，分泌蛋白MbovP0581是一種ABC轉(zhuǎn)運蛋白，具有強的免疫原性，能與牛支原體感染血清反應(yīng)，有作為疫苗抗原的潛力[19]。一些牛支原體蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)和免疫保護作用已被評估。GAPDH在牛支原體菌株中非常保守，參與糖酵解過程，被認(rèn)為是牛支原體的一種毒力因子和免疫保護抗原。Prysliak等[20]將牛支原體GAPDH與宿主防御肽組成嵌合蛋白Gap-I、嵌合蛋白Gap-I和牛支原體提取物作為疫苗抗原，與CpG2007佐劑混合制成亞單位疫苗，結(jié)果顯示亞單位疫苗可引起強烈的體液免疫，而細(xì)胞免疫較弱，不具有免疫保護作用。Mulongo等[21]將兩株牛支原體總蛋白和/或膜蛋白結(jié)合CpG ODN2007佐劑制備成疫苗，發(fā)現(xiàn)總蛋白和膜蛋白混合組能顯著引起IgG1血清學(xué)反應(yīng)，總蛋白組誘導(dǎo)明顯的IgG2反應(yīng)，但是均不能引起淋巴細(xì)胞記憶性應(yīng)答；攻毒后免疫組與對照組在臨床癥狀和病原分布無顯著差異，表明研制疫苗不具有免疫保護作用。Prysliak等[22]應(yīng)用SDS-PAGE、2D結(jié)合免疫印跡方法，鑒定出PdhA、Tuf、PepA、P48、P81、DeoB、OppA、LppB、O256、PepQ，它們可作為潛在疫苗候選蛋白，將這些重組蛋白、膜蛋白、總蛋白配合佐劑TriAdj后免疫犢牛，重組蛋白可產(chǎn)生IgG1或IgG2反應(yīng)，但沒有誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，不具有免疫保護作用。Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答在多種支原體的抗感染中發(fā)揮重要作用，如肺支原體(M.pulmonis)[23]、肺炎支原體(M.pneumoniae)[24]等。研究者使用MontanideTMISA 61VG和Th17應(yīng)答誘導(dǎo)劑凝膠多糖為佐劑，牛支原體膜組分、總蛋白和9個重組蛋白(PdhA、Tuf、PepA、LppB、O256、OppA、DeoB、P81、PepQ)組成混合抗原，制成疫苗免疫犢牛，發(fā)現(xiàn)除膜組分外，其余抗原刺激PBMC均能引起Th17細(xì)胞反應(yīng)；該疫苗能夠誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，血清中IgG1、IgG2和IgA水平較對照組顯著上升；但疫苗組僅能輕微減輕牛支原體引起的肺部病變和體重下降，不具有免疫保護作用，表明該疫苗誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答不能對牛支原體感染提供有效保護[25]。牛支原體具有膜表面抗原高頻率變異、規(guī)避吞噬細(xì)胞吞噬作用、入侵宿主細(xì)胞、形成生物被膜以及免疫調(diào)節(jié)作用等方面逃避宿主天然和適應(yīng)性免疫[9,26-28]，使得亞單位疫苗的研制面臨諸多挑戰(zhàn)。本實驗室近期研究發(fā)現(xiàn)牛支原體生物被膜與浮游細(xì)胞共有的免疫原性蛋白，如endoglucanase、thiol peroxidase、MilA，有可能作為潛在疫苗靶標(biāo)預(yù)防牛支原體急性感染和生物被膜感染[29]。最近發(fā)現(xiàn)，針對膜蛋白P81和UgpB的多抗能夠抑制牛支原體的生長，提示膜蛋白P81和UgpB可作為潛在疫苗候選抗原[30]。到目前為止，一些免疫原性蛋白被鑒定并進行了牛體驗證，可引起強烈的以抗體為介導(dǎo)的體液免疫，但都不具有免疫保護作用。細(xì)胞免疫在牛支原體免疫中發(fā)揮著重要作用，Th17細(xì)胞免疫不具有免疫保護作用。因此，鑒定有效新抗原或抗原組合，平衡Th1/Th2細(xì)胞免疫，對于牛支原體病亞單位疫苗研發(fā)非常重要。

3 豬肺炎支原體

目前，已鑒定了一些豬肺炎支原體免疫蛋白，如P36、P42、P46、P95、P97、P102、P116、Nrdf等，可作為疫苗候選抗原。劉茂軍等[31]原核表達了豬肺炎支原體P65基因，發(fā)現(xiàn)P65重組蛋白具有良好的免疫原性。Galli等[32]發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體p42和p95能夠在BALB/c小鼠誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，對豬肺炎支原體7個重組蛋白在小鼠的免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，能誘導(dǎo)IgG1 和 IgG2a 抗體反應(yīng)。馬豐英等[33]重組表達了豬肺炎支原體的主要免疫蛋白p36、p46、p65和p97R1-Nrdf，重組蛋白組合制備亞單位疫苗，檢測發(fā)現(xiàn)疫苗組(p36、p46、p65和p97R1-Nrdf)能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很強的體液免疫反應(yīng)，血清中抗體水平高于常規(guī)疫苗，同時，也激活了細(xì)胞免疫，IFN-γ水平顯著高于常規(guī)疫苗組。對豬肺炎支原體的P1C、P116 N、P30評價，串聯(lián)嵌合這3個蛋白的MP559 能夠引起較高水平的體液免疫反應(yīng)[34]。巴西學(xué)者構(gòu)建了豬肺炎支原體rP97R1P46P95P42嵌合抗原亞單位疫苗，發(fā)現(xiàn)在小鼠試驗中具有良好的免疫原性，可作為一種潛在的疫苗[35]。豬肺炎支原體表面黏附素P97蛋白的C端重復(fù)區(qū)域R1和R1R2，與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基融合形成嵌合蛋白rLTBR1和rLTBR1R2，與IMS 1113佐劑混合乳化后免疫小鼠，每個重組蛋白均能誘導(dǎo)抗R1特異性的體液抗體(IgG)、黏膜抗體(IgG和IgA)和IFN-γ的產(chǎn)生，嵌合蛋白rLTBR1R2在重組蛋白中引起最快的體液抗體應(yīng)答，有作為亞單位疫苗的前景[36]。很多豬肺炎支原體亞單位疫苗研究在小鼠中進行免疫保護效果評價，并未進行豬體試驗。小鼠并不能代表豬體免疫反應(yīng)，一些在小鼠上具有潛力的亞單位疫苗需要進行豬體試驗驗證。對P97/P102類似物亞單位疫苗豬體免疫發(fā)現(xiàn)，盡管可以誘導(dǎo)很強的體液免疫，保護纖毛免受損傷，肺組織病變卻加重，不具有免疫保護作用[37]。熱休克蛋白 P42重組蛋白在豬體能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，有作為亞單位疫苗候選蛋白的潛力[38]。目前，一些免疫蛋白或片段具有免疫原性，可作為亞單位疫苗的候選抗原，但免疫保護效果都不理想。鑒定新的有效疫苗候選蛋白或多抗原蛋白組合(或嵌合)是豬支原體肺炎亞單位疫苗研究的一個重要發(fā)展方向[39]。

4 雞毒支原體

雞毒支原體的一些疫苗候選免疫蛋白已被鑒定，如GroEL、EF-Tu、greA、PDHC、DnaK、P67 (pMGA)、P52[40]等；通過免疫蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)，EF-Tu、greA、PDHC、DnaK、GroEL等具有良好的免疫原性。對GroEL蛋白進一步研究發(fā)現(xiàn)，其具有ATPase活性，參與MG PrpC蛋白的重折疊。補體依賴殺菌試驗表明，MG rGroEL的兔抗血清具有良好的殺菌效果，與滅活疫苗誘導(dǎo)的抗血清相似，提示MG GroEL是一種保護性抗原，可作為MG亞單位疫苗候選抗原[41]。MGC1和MGC2是MG重要的黏附因子，MGC1和MGC2重組蛋白混合油佐劑制成亞單位疫苗，不同濃度重組蛋白免疫家禽，ELISA結(jié)果顯示，兩種蛋白制劑均引起較強的免疫應(yīng)答，且不同劑量反應(yīng)水平接近，證明MGC1和MGC2重組蛋白具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但卻不具有免疫保護作用[42]。

5 山羊支原體山羊肺炎亞種

隨著Mccp基因組解析[43-45]和免疫蛋白組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，一些潛在的疫苗抗原被發(fā)現(xiàn)，如PDHC、HSP70、轉(zhuǎn)酮醇酶、延長因子G、LDH、NAD家族蛋白、NADPH、Ef-Tu等[46-47]，有作為亞單位疫苗候選抗原的潛力。GlpO是Mccp的一個毒力因子，具有作為疫苗抗原和治療靶標(biāo)的潛力[48]。然而最新研究發(fā)現(xiàn)GlpO存在于包括Mccp和Mmm SC等在內(nèi)的所有絲狀支原體簇成員的細(xì)胞質(zhì)，GlpO并不是絲狀支原體簇理想的保護性應(yīng)答的候選抗原[49]。PDHA、PDHB、PDHC是Mccp主要的免疫原性蛋白，預(yù)測并篩選其相關(guān)的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，構(gòu)建多重抗原肽(MAP)，原核表達后免疫小鼠，結(jié)果顯示3種抗原均能和小鼠免疫血清發(fā)生很好的反應(yīng)，免疫血清具有體外代謝抑制作用；淋巴細(xì)胞增殖試驗顯示，當(dāng)用單個T細(xì)胞表位及Mccp超聲破碎抗原分別刺激免疫小鼠的淋巴細(xì)胞時均產(chǎn)生明顯的增殖現(xiàn)象，免疫小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-10產(chǎn)量明顯升高，而IL-12產(chǎn)量明顯下降。研究表明，構(gòu)建的MAP能夠引起小鼠的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[50]。

6 動物支原體病亞單位疫苗研發(fā)的主要難題

動物支原體病亞單位疫苗研發(fā)尚處于探索初期，國內(nèi)外尚未見商業(yè)化亞單位疫苗問世。以下是阻礙亞單位疫苗研發(fā)的3個主要難題：

1)抗原設(shè)計：支原體病亞單位疫苗研發(fā)，首先需要確定支原體的保護性抗原基因。支原體保護性免疫成分主要包括參與病原黏附與致病的成分。細(xì)胞免疫和黏膜免疫在支原體保護性免疫應(yīng)答中往往起重要作用。因此，在亞單位疫苗抗原選擇時應(yīng)充分考慮到細(xì)胞免疫與黏附免疫相關(guān)抗原和表位。一些保護性抗原中可能存在參與免疫逃避、免疫病理損傷、誘導(dǎo)免疫副反應(yīng)或自身免疫應(yīng)答的表位，因此在設(shè)計時需要對相應(yīng)表位進行修飾或刪除；在抗原中添加靶向修飾序列，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔靶向轉(zhuǎn)運的KDAEL基序，可增強抗原的免疫效果[51]。由于支原體無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，膜蛋白是其主要免疫原之一，膜抗原包括糖蛋白、脂蛋白、熱休克蛋白等，是支原體主要的免疫抗原[52]。

2)抗原的高效遞送系統(tǒng)：在基因工程亞單位疫苗的研制中，需要根據(jù)表達抗原的特點選擇合適的表達系統(tǒng)；目前，基因工程亞單位疫苗的表達系統(tǒng)有原核生物、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞表達系統(tǒng)等；在選擇表達系統(tǒng)時需注意所表達抗原是否有糖基化等翻譯后修飾。由于原核表達系統(tǒng)缺乏相關(guān)的翻譯后修飾，會影響蛋白抗原的生物學(xué)活性和免疫原性。此外，需要根據(jù)重組蛋白的免疫原形式確定表達系統(tǒng)，如目的蛋白是單體形式還是多聚體形式。另外，在設(shè)計和構(gòu)建重組表達載體時，可以將佐劑與免疫原融合表達，提高細(xì)胞免疫和體液免疫[51]。

3)細(xì)胞免疫、黏膜免疫佐劑：重組蛋白抗原往往需要配以合適的佐劑以增強免疫原性。細(xì)胞免疫和黏附免疫在支原體保護性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞免疫和黏附免疫佐劑(如IMS 1113、LTB亞基)可增強豬肺炎支原體的免疫效果[36]。

7 展 望

運用反向疫苗學(xué)的方法，在篩選鑒定絲狀支原體絲狀亞種、豬肺炎支原體等重要支原體保護性抗原方面取得進展，MSC-0136、MSC-0957、MSC-0499、MSC-0431、MSC-0776等為絲狀支原體絲狀亞種保護性抗原，能誘導(dǎo)牛體產(chǎn)生保護性免疫，可用于預(yù)防牛傳染性胸膜肺炎[18]。P97、P42、NrdF等為豬肺炎支原體的保護性抗原[53]?，F(xiàn)有研究提示，單一支原體免疫蛋白往往難以誘導(dǎo)理想的免疫反應(yīng)和產(chǎn)生良好的免疫保護，多組分抗原(組合或嵌合表達)可克服這一缺陷，誘導(dǎo)較全面的免疫反應(yīng)，可能會產(chǎn)生較好的免疫保護效果。理想的支原體亞單位疫苗應(yīng)該有效激活機體體液免疫和細(xì)胞免疫，甚至黏膜免疫，抵御或清除病原的感染。以豬肺炎支原體為例，發(fā)現(xiàn)和鑒定更加有效的免疫保護抗原或抗原組合，根據(jù)抗原特點篩選高效的抗原遞送系統(tǒng)，如減毒鼠傷寒沙門菌[54]或腺病毒等[55]遞送系統(tǒng)，相應(yīng)抗原配合更有效的佐劑，如IMS 1113[36]、LTB 亞基[56]、氯化鋰[57]、介孔二氧化硅納米顆粒[58]等，增強疫苗免疫保護效果[59]。因此，深入研究支原體蛋白的免疫反應(yīng)，篩選保護性抗原、抗原表位，抗原設(shè)計，選擇高效的抗原遞送系統(tǒng)，配合合適的佐劑可提高支原體亞單位疫苗免疫保護效果，為新型疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。