王康，賈軍梅，仇海樂，陳佩瑤，伊佳虹，張沙沙

作者單位：1山西醫(yī)科大學，山西 太原030001；2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山西 太原030001

在全球癌癥發(fā)病率和死亡率排名中，結(jié)腸癌分別排在第三和第四位[1]。全球每年約有100 多萬結(jié)腸癌新發(fā)病例，70 萬結(jié)腸癌死亡病例[2]。目前臨床上結(jié)腸癌的治療主要以手術(shù)治療為主，同時輔以放療和化療的綜合治療措施。由于早期結(jié)腸癌缺乏特異性特征，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，其五年生存率不到40%。因此尋找新的治療方法和策略以提高結(jié)腸癌的治療效果已成為臨床研究的熱點?；蛑委煘榘┌Y的治療提供了一個新概念。明確結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學和遺傳學特征可以為基因治療提供新的證據(jù)[3]。

G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR）是具有7 個跨膜域的膜蛋白，它們調(diào)節(jié)與多種疾病相關(guān)的各種生理過程［4］。富含亮氨酸重復序列的G 蛋白偶聯(lián)受體6（LGR6）與LGR4 和LGR5 具有高度的同源性，它們在激活Wnt 途徑中發(fā)揮作用［5］。有學者發(fā)現(xiàn)LGR6 是一組基底和腔內(nèi)祖細胞的標志物，這些細胞誘導腔內(nèi)乳腺腫瘤的發(fā)生［6］。LGR6在胃癌中升高，并與局部腫瘤生長相關(guān)［7］。轉(zhuǎn)錄組學分析結(jié)果顯示，LGR6 在20%～50%的結(jié)腸癌病例中存在高甲基化［8］，然而其作用機制尚不明了。本研究自2019 年4—8 月通過下調(diào)結(jié)腸癌SW480 細胞LGR6 的表達，觀察對結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 結(jié)腸癌細胞株SW480 購自中國科學院（上海）典型培養(yǎng)庫。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（批號20151206）及0.25%胰蛋白酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（批號919437）和Trizol 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號50175111）均購自武漢科昊佳生物科技有限公司；MTT 和Transwell 小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司。LGR6 的小干擾RNA（LGR6 siRNA）序列購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。LGR6 陰性對照（LGR6 siCtrl）購自中國通用生物系統(tǒng)公司。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific 公司。4800型PCR儀購自美國Bio-Rad 公司。352 型酶標儀和DR2700分光光度計均購自美國HACH 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將SW480 細胞接種在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，并在37 ℃和5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天更換新鮮培養(yǎng)基并檢測細胞密度。當細胞密度達到80% ～90%時，將細胞用0.25%胰蛋白酶消化并進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW480 細胞制成單細胞懸液（密度為：2×105個細胞/毫升），并接種在6 孔板上，每2 天更換一次培養(yǎng)液。當細胞生長密度達到50%～60%時，將其分為實驗組、陰性對照組和空白對照組。嚴格按照Lipofectamine 2000 的說明書要求，實驗組細胞轉(zhuǎn)染LGR6siRNA，陰性對照組細胞轉(zhuǎn)染LGR6 siCtrl，空白對照組只轉(zhuǎn)染試劑。處理后將細胞在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)72 h［9］。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)LGR6 mRNA 表達水平 使用TRIzol 試劑（Invitgen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）從細胞中提取總RNA。使用cDNA 合成試劑盒（北京天根）合成cDNA。以根據(jù)制造商的方案使用SYBR-Green 進行qPCR 分析，反應(yīng)系統(tǒng)包含2 μL cDNA，0.5 μL 正向引物（10 NM），0.5 μL 反向引物（10 NM），10 μL SYBR-格林緩沖液和7 μL 蒸餾水。使用ABI7500 進行數(shù)據(jù)收集。反應(yīng)條件如下，50°C 2 min，95 °C2 min，95 °C15 s，60 °C 1 min。40 個循環(huán)。熔體曲線分析的條件為95 °C 15 s，60 °C 1 min和95°C 15 min。引物序列如表1所示。采用2-ΔΔCt法計算LGR6 mRNA的相對表達量。

表1 LGR6 mRNA和GAPDH引物序列

1.2.4 轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)蛋白表達水平 采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）技術(shù)分別檢測實驗組和對照組LGR6 蛋白表達水平：制備培養(yǎng)細胞全細胞提取物，并使用RIPA 裂解緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)研究所）進行蛋白印跡分析。用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白（50 μg），并將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上（美國EMD Milliperate）。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜1 h。加入一抗在4°C下孵育過夜。用PBS-Tween-20 洗滌3 次，每次10 min，加入山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。使用增強的化學發(fā)光Western印跡檢測系統(tǒng)（Invitrogen）和X射線膠片對印跡進行顯影。頻帶密度通過ImageJ 軟件（美國馬里蘭州貝塞斯達的國立衛(wèi)生研究院）進行鑒定。以GAPDH 作為內(nèi)參，計算LGR6、Bax、Cleaved caspase 3、β-連 環(huán) 蛋 白（βcatenin）和c-Myc蛋白表達水平。

1.2.5 SW480 增殖活性檢測 分別取實驗組和對照組細胞懸液各100 μL（含約2 000 個細胞）置于96 孔培養(yǎng)皿中。每孔加入100 μL MTT 溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育。直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan 全部溶解。記錄570 nm處吸光度值。

1.2.6 Transwell 小室法檢測結(jié)腸癌SW480 細胞侵襲 轉(zhuǎn)染后72 h，將SW480 細胞用用無菌PBS 洗滌2 次，用無血清RPMI 1640 重懸，調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL。將含有10%BSA 的RPMI 1640 培養(yǎng)液600 μL 加入24 孔板中，每個Transwell 小室加入200 μL 細胞懸液后放入24 孔板。每組做5 個復孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，去除小室上室面細胞。并以95%的酒精固定小室約10 min，再以Giemsa 染液染色10 min PBS 沖洗后常溫干燥。光鏡下拍照，每個Transwell小室隨機選10個視野光鏡下拍照，取平均值進行統(tǒng)計。

1.2.7細胞凋亡實驗 轉(zhuǎn)染后72 h，將SW480 細胞用0. 25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化收集，用PBS洗滌2 次，懸浮于500 μL Binding Buffer 緩沖液中，然后與5 μL Annexin V-FITC 混合，最后再加入5 μL PI 混勻，并在室溫下反應(yīng)10 min。采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析，所有實驗數(shù)據(jù)結(jié)果均以x ± s表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t 法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SW480 細胞轉(zhuǎn)染LGR6 基因結(jié)果比較qPCR分析顯示，實驗組、陰性對照組和空白對照組LGR6 mRNA 表達水平分別為（0.42±0.08）、（1.12±0.08）、（1.13±0.31），實驗組LGR6 mRNA 表達水平顯著降低（P ＜0.05）。Western-Blot 結(jié)果顯示，實驗組LGR6蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05）；陰性對照組和空白對照組LGR6 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 SW480細胞轉(zhuǎn)染LGR6基因結(jié)果及Western-Blot結(jié)果比較：A為基因結(jié)果；B為Western-Blot結(jié)果

2.2 SW480 細胞增殖活性比較細胞活性檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 時實驗組細胞增殖活性（0.24±0.04）、（0.27±0.06）、（0.45±0.08）、（0.63±0.09）顯著低于陰性對照組（0.22±0.03）、（0.40±0.05）、（0.92±0.07）、（1.32±0.11）和 空 白 對 照 組（0.26±0.04）、（0.42±0.07）、（0.94±0.09）、（1.21±0.12），均P ＜0.05，空白對照組和陰性對照組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 結(jié)腸癌SW480細胞增殖活性

2.3 SW480 細胞侵襲能力比較Transwell 實驗表明：實驗組結(jié)腸癌SW480細胞侵襲細胞數(shù)為（42.38±6.12）×103個，陰性對照組組（94.21±16.54）×103個；空白對照組（97.76±18.24）×103個。實驗組侵襲細胞數(shù)顯著低于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05）。陰性對照組和空白對照組侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖3。

圖3 結(jié)腸癌SW480細胞侵襲能力比較：A為兩組Transwell圖；B為兩組侵襲細胞數(shù)比較

2.4 SW480 細胞凋亡水平比較細胞凋亡實驗顯示，實驗組、陰性對照組和空白對照組細胞凋亡率（%）分別為（8.04±1.76）、（1.91±0.42）、（1.88±0.31），實驗組結(jié)腸癌SW480 細胞凋亡率顯著高于陰性對照組和空白對照組（P ＜0. 05）；空白對照組和陰性對照差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖4。

圖4 結(jié)腸癌SW480細胞凋亡水平比較

2.5 SW480細胞Wnt/βcatenin相關(guān)蛋白表達水平比較轉(zhuǎn)染后48 h，實驗組Bax和Cleaved caspase 3蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組和（P ＜0.05）；β catenin和c-Myc蛋白表達顯著低于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05）。陰性對照組和空白對照組Bax、Cleaved caspase 3、β catenin和c-Myc蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖5。

圖5 細胞內(nèi)LGR6蛋白表達水平

3 討論

結(jié)腸癌是一種惡性腫瘤，屬于高致死性腫瘤之一［10］。隨著中國經(jīng)濟的快速發(fā)展，結(jié)腸癌在中國的發(fā)生率也呈現(xiàn)逐年增加趨勢，如今已成為中國高發(fā)的腫瘤之一，尤其在廣東和上海等城市［11］。結(jié)腸癌的形成是一個逐漸發(fā)展的過程，是由多因素導致的綜合性腫瘤，包括內(nèi)源性因素和外部刺激等。環(huán)境因素諸如抽煙，喝酒均可能引起關(guān)鍵信號通路（如MAPK 信號通路和Wnt 信號通路等）的變化，進而引起結(jié)腸癌的發(fā)生。先前研究發(fā)現(xiàn)LGR6 在多種腫瘤中上調(diào)，如基底細胞樣皮膚癌［12］和胃癌［13］。Ruan等［14］研究發(fā)現(xiàn)，沉默LGR6 的表達可通過抑制Wnt/β-Catenin 信號通路降低卵巢癌細胞的化療耐藥性。Wang 等［15］發(fā)現(xiàn)LGR6 的表達可作為結(jié)腸腺癌患者獨立的預后指標。本研究實驗組LGR6 蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組。陰性對照組和空白對照組LGR6 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，證明LGR6 siRNA 轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染后實驗組細胞OD 值和侵襲細胞數(shù)均顯著低于陰性對照組和空白對照組（P ＜0.05），細胞凋亡率顯著高于陰性對照組和空白對照組，說明下調(diào)LGR6 可抑制結(jié)腸癌SW480 細胞增殖和侵襲，并促進細胞凋亡。與先前的研究一致。

Wang 等［16］研究發(fā)現(xiàn)LGR6 通過PI3K/AKT 通路促進HCT-116 和SW480結(jié)腸癌細胞的增殖和侵襲。Wnt/β catenin信號通路在調(diào)節(jié)多種類型腫瘤細胞增殖過程中發(fā)揮重要的作用，近90%結(jié)腸癌的發(fā)生都與此信號通路的激活有關(guān)［17］。有學者發(fā)現(xiàn)，激活Wnt/β catenin信號通路可導致β-catenin轉(zhuǎn)運至細胞核，并激活下游靶基因如c-Myc、cyclin D1 等，從而參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展［18］。也有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β catenin信號通路的抑制可抑制結(jié)腸癌細胞增殖并誘導凋亡［19］。尚無研究探討LGR6 對結(jié)腸癌細胞Wnt/β catenin 信號通路的影響。本研究以Wnt/β catenin 信號通路為切入點，從另一方面探討了LGR6 影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的可能機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組細胞中促進凋亡誘導分子Bax 和Cleaved caspase 3蛋白表達顯著高于陰性對照組和空白對照組，且Wnt 信號通路的關(guān)鍵分子β catenin 和下游靶基因c-Myc 的蛋白表達顯著低于陰性對照組和空白對照組，說明下調(diào)LGR6 可能通過調(diào)節(jié)Wnt/βcatenin 信號通路而抑制結(jié)腸癌SW480 細胞增殖和侵襲，誘導細胞凋亡。

綜上所述，LGR6 低表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而抑制結(jié)腸癌SW480 細胞的增殖和侵襲并促進細胞凋亡，抑制結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。然而，尚需深入和系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究了解其具體機制與結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系。