羅瓊，李琴，石秀禎，郭愛莉，李靜

作者單位：1長江航運(yùn)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢430010；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢430022

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是最常見的代謝性疾病，近年來，隨著人們生活方式的改變和人口老齡化等因素的影響，糖尿病的發(fā)病率正在逐漸增加，已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三大危害人類健康的重大疾?。?-2］。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一［3］。DN 的主要病理改變表現(xiàn)為腎臟纖維化［4］，而轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作為促進(jìn)腎臟纖維化的細(xì)胞因子之一，在慢性腎病中起著至關(guān)重要的作用，作為主要的治療靶點(diǎn)正在逐漸被臨床所認(rèn)可［5-6］。已有研究發(fā)現(xiàn)：TGF-β1 可通過激活Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)腎上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致腎纖維化，最終進(jìn)展為腎功能不全［7］。大量研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smads 信號通路與糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展及腎臟纖維化密切相關(guān)［8-9］。

目前臨床上公認(rèn)的糖尿病腎病的治療方案常常在嚴(yán)格控制控制飲食、血糖、血脂、血壓的基礎(chǔ)上，應(yīng)用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（Angiotensin Ⅱreceptor antagonist，AngⅡ）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）等藥物加以防治，但這些措施很難完全有效延緩糖尿病腎病向終末期腎病發(fā)展［10］。中醫(yī)藥在糖尿病的防治上取得了顯著的成效，復(fù)方丹參滴丸（compound Danshen dripping pills，DSP）是一種新型中藥制劑，是目前臨床上用于緩解和治療糖尿病腎臟病變、冠心病等的常見藥物之一。已有研究發(fā)現(xiàn)［11-14］，復(fù)方丹參滴丸對糖尿病患者早期腎病損害具有明顯的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制并不完全清楚。因此，本研究通過觀察DSP 對DM 大鼠腎臟TGF-β1/Smads 信號通路的影響，從而探討DSP 對糖尿病腎臟保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取50 只6～8 周齡的健康清潔級、雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購于昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，室溫（24±2）℃，濕度（45±5）%，自然光照，室內(nèi)保持安靜。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 復(fù)方丹參滴丸（天士力制藥集團(tuán)股份有限公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司）；TGF-β1 兔抗大鼠一抗、重組人β 肌動蛋白（β-actin）兔抗大鼠一抗、羊抗兔IgG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；p-Smad2、p-Smad3 的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（Cell Signaling 公司）；Smad7、腎損傷分子-1（KIM-1）、骨橋蛋白（OPN）的ELISA 試劑盒（武漢華美公司）；RIPA 裂解液（凱基生物）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（凱基生物）；PCR 引物（博士德生物）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（Taka-Ra）。

1.1.3 主要儀器 全自動生化分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；血糖儀及配套試紙（三諾生物傳感股份有限公司）；ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）、電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，按隨機(jī)數(shù)字表法將50 只大鼠隨機(jī)分為空白對照組（NC組，n=10）、造模組（n=40）。然后造模組大鼠使用腹腔注射1%鏈脲佐菌素（60 mg/kg）進(jìn)行造模，對照組大鼠腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液（0.1 mol/L），在72 h 后尾靜脈采血，從而測定血糖濃度≥16.7 mmol/L時為造模成功［15］。

1.2.2 造模后處置 其中大鼠成模37 只，死亡3只，成模率為92.50%。最后從中選取造模成功的30只老鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病模型組（DM組，n=10）、復(fù)方丹參滴丸低劑量組（DSP 低劑量組，n=10）、復(fù)方丹參滴丸高劑量組（DSP 高劑量組，n=10）。DSP 低、高劑量組大鼠每天分別給予200、400 mg/kg 的DSP 與生理鹽水混懸液灌胃治療，NC 組及DM 組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃，均每日1 次，持續(xù)8周。

1.2.3 血糖、血肌酐、尿素氮檢測 實驗結(jié)束，血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）水平。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后靜脈取血，分離血清，使用全自動生化分析儀進(jìn)行各組大鼠的血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的檢測。

1.2.4 熒光定量PCR 法檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表達(dá)水平 取各組腎臟組織50 mg，先提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。其中反應(yīng)體 系 是20 μL，反 應(yīng) 條 件 是stage1：95 ℃，30 s。stage2：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40 個循環(huán)。PCR 擴(kuò)增的特異性引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增的特異性引物序列

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1 的蛋白表達(dá) 取各組腎臟組織80 mg，提取總蛋白，測定其濃度，上樣等質(zhì)量的蛋白。然后電泳、進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育TGF-β1 一抗（1∶1 000）4 ℃過夜，用TBST 清洗，37 ℃孵育二抗（1∶10 000）1 h，再次用TBST 清洗，最后用ELC 發(fā)光試劑盒顯影。蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.2.6 ELISA 法檢測各組大鼠尿中KIM-1、尿中OPN 以及腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7的濃度表達(dá)水平 代謝籠收集各組大鼠尿液，然后采用ELISA 試劑盒檢測各組大鼠尿中KIM-1、OPN 的濃度。取部分新鮮的腎臟組織，使用ELISA 試劑盒檢測各組大鼠腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3、Smad7的濃度表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。觀測資料均為計量數(shù)據(jù)，采用x ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析，組間方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane’s T2（M）檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖比較與NC組相比，DM組大鼠血糖明顯升高（P ＜0.05）；與DM 組相比，DSP 低、高劑量組大鼠血糖明顯降低（P ＜0.05），且高劑量組較低劑量組有進(jìn)一步下降的趨勢。見表2。

2.2 各組大鼠腎損傷標(biāo)志物水平的比較與NC 組相比，DM組大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN濃度明顯升高（P ＜0.05），提示糖尿病引起了大鼠腎臟損傷；與DM組比較，DSP低、高劑量組大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN 濃度明顯降低（P ＜0.05），且高劑量組尿KIM-1、尿OPN 濃度明顯低于低劑量組（P ＜0.05），說明DSP劑量依賴性地改善了糖尿病大鼠的腎臟損傷，對糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。見表2。

2.3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)與NC組相比，DM組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA與蛋白表達(dá)均明顯升高（P ＜0.05）；與DM組相比，DSP低、高劑量組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA與蛋白均明顯減低（P ＜0.05），且高劑量組明顯低于低劑量組（P ＜0.05），說明DSP劑量依賴性地抑制了糖尿病大鼠的腎臟TGF-β1表達(dá)。見表3，圖1。

2.4 各組大鼠腎臟組織Smads 的mRNA 和蛋白表達(dá)

2.4.1 各組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表達(dá) 與NC 組比較，DM 組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P ＜0.05），而Smad7 的mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P ＜0.05）；與DM 組比較，DSP 低、高劑量組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3 的mRNA 表達(dá)水平均明顯減低（P ＜0.05），而Smad7 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P ＜0.05）；且DSP 高劑量組Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平低于DSP 低劑量組（P ＜0.05），Smad7 的mRNA 表達(dá)水平高于DSP 低劑量組（P ＜0.05）。見表4。

表2 各組大鼠血糖及腎損傷標(biāo)志物水平的比較/x ± s

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)/x ± s

圖1 各組大鼠腎臟組織的蛋白表達(dá)（n=10）

表4 各組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)/x ± s

2.4.2 各組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7 的蛋白表達(dá) 與NC 組比較，DM 組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3 的蛋白水平明顯升高（P ＜0.05），而Smad7 的蛋白水平明顯降低（P ＜0.05）；與DM 組比較，DSP 低、高劑量組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表達(dá)水平均明顯減低（P ＜0.05），而Smad7 的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P ＜0.05）；且DSP 高劑量組p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表達(dá)水平低于DSP 低劑量組（P ＜0.05），Smad7 的蛋白表達(dá)水平高于DSP低劑量組（P ＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7的蛋白表達(dá)/x ± s

3 討論

糖尿病在中醫(yī)學(xué)中被稱為“消渴”，而“糖尿病腎病”是消渴病并發(fā)癥，發(fā)于腎臟，因此呂仁和教授稱其為消渴病腎病［16］。消渴病腎病的基本病機(jī)為“腎虛血瘀”，而活血益氣法是治療此病的主要措施，并特別強(qiáng)調(diào)活血法貫穿整個治療過程［17-19］。DSP 是一種新型中藥制劑，以丹參、冰片、三七等中藥為主要成分，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，且具有起效迅速、生物利用度高的特點(diǎn)［20］。其中丹參味苦、性微寒，是主要的活血化瘀中藥，古代醫(yī)書上有“一味丹參，功同四物（當(dāng)歸、川芍、白芍、熟地）”之說。冰片辛香而寒涼，善于開竅醒神、清熱止痛。三七味苦而甘、性溫，具有良好的活血化瘀、止血止痛的功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)：DSP 可改善DM 動物模型的胰島功能、降低血糖水平、緩解炎癥反應(yīng)［21］、改善DM所引起的心臟［22］、腎臟［23］等臟器的損傷，在DM 及其多種并發(fā)癥的防治上顯示了較好的療效［24-26］。

DN 是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一［27］。當(dāng)血清Scr、BUN及尿KIM-1、OPN 等指標(biāo)出現(xiàn)異常的時候，可以提示糖尿病可能出現(xiàn)了腎病的并發(fā)癥［28-29］。在評價腎功能損傷時，尿KIM-1、尿OPN 比血肌酐、尿素氮等指標(biāo)更為敏感，因為血肌酐、尿素氮常常在腎功能嚴(yán)重下降時才會發(fā)生明顯的變化，而尿KIM-1、尿OPN水平常常在腎臟存在輕微病變時就會發(fā)生比較明顯的變化，所以可以被用來評價腎臟的早期損傷［30-31］。本研究發(fā)現(xiàn)：與NC 組比較，DM 組大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮濃度明顯升高，提示糖尿病大鼠模型出現(xiàn)腎臟的損傷；與DM 組比較，DSP 低、高劑量組大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮濃度明顯降低，且高劑量組大鼠尿KIM-1、OPN 濃度明顯低于低劑量組，提示DSP 劑量依賴性地改善了糖尿病大鼠的腎臟損傷，對糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

TGF-β1是TGF-β家族中的一個核心成員，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)：若腎臟中TGFβ1 的表達(dá)水平過高，則可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長、增加細(xì)胞外基質(zhì)含量，從而引起腎臟硬化［32］。TGFβ1/Smads 信號通路作為TGF-β1 介導(dǎo)的重要信號通路，在腎臟纖維化中發(fā)揮著不可替代的作用［33-34］。其中，TGF-β1 可與TGF-β1Ⅱ型受體結(jié)合，從而激活TGF-β1Ⅰ型受體并將Smad2、Smad3蛋白磷酸化，而磷酸化的Smad2/Smad3 與Smad4 形成活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響一些參與腎臟損傷分子的表達(dá)［35-36］。Smad7是TGF-β1信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，主要通過與TGF-β1Ⅰ型受體結(jié)合抑制TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［37］。大量研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病模型大鼠體內(nèi)TGF-β1 水平呈高表達(dá)，而Smads 信號表達(dá)異常的狀態(tài)［38］。本研究結(jié)果顯示：與NC 組相比，DM 組大鼠腎臟TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯升高；Smad2、Smad3 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高，而Smad7的mRNA表達(dá)水平明顯降低；p-Smad2、p-Smad3 的濃度明顯升高，而Smad7 的濃度明顯降低。與DM 組相比，DSP 低、高劑量組大鼠腎臟TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯降低；Smad2、Smad3 的mRNA 表 達(dá) 水 平 明 顯 降 低，p-Smad2、p-Smad3 的濃度明顯降低，且高劑量組明顯低于低劑量組；而Smad7 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高，Smad7的濃度明顯升高，且高劑組明顯高于低劑量組。提示：DSP 劑量依賴性的抑制了糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號通路的表達(dá)。

綜上所述，DSP 可能通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路，從而延緩STZ誘發(fā)的DM大鼠腎損害。