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        復(fù)方丹參滴丸對糖尿病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smads信號通路表達(dá)的影響

        2021-03-05 06:32:50羅瓊李琴石秀禎郭愛莉李靜
        安徽醫(yī)藥 2021年2期
        關(guān)鍵詞:劑量糖尿病水平

        羅瓊,李琴,石秀禎,郭愛莉,李靜

        作者單位:1長江航運(yùn)總醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北 武漢430010;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科,湖北 武漢430022

        糖尿?。╠iabetes mellitus,DM)是最常見的代謝性疾病,近年來,隨著人們生活方式的改變和人口老齡化等因素的影響,糖尿病的發(fā)病率正在逐漸增加,已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三大危害人類健康的重大疾?。?-2]。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一[3]。DN 的主要病理改變表現(xiàn)為腎臟纖維化[4],而轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)作為促進(jìn)腎臟纖維化的細(xì)胞因子之一,在慢性腎病中起著至關(guān)重要的作用,作為主要的治療靶點(diǎn)正在逐漸被臨床所認(rèn)可[5-6]。已有研究發(fā)現(xiàn):TGF-β1 可通過激活Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)腎上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換,從而導(dǎo)致腎纖維化,最終進(jìn)展為腎功能不全[7]。大量研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1/Smads 信號通路與糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展及腎臟纖維化密切相關(guān)[8-9]。

        目前臨床上公認(rèn)的糖尿病腎病的治療方案常常在嚴(yán)格控制控制飲食、血糖、血脂、血壓的基礎(chǔ)上,應(yīng)用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(Angiotensin Ⅱreceptor antagonist,AngⅡ)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors,ACEI)等藥物加以防治,但這些措施很難完全有效延緩糖尿病腎病向終末期腎病發(fā)展[10]。中醫(yī)藥在糖尿病的防治上取得了顯著的成效,復(fù)方丹參滴丸(compound Danshen dripping pills,DSP)是一種新型中藥制劑,是目前臨床上用于緩解和治療糖尿病腎臟病變、冠心病等的常見藥物之一。已有研究發(fā)現(xiàn)[11-14],復(fù)方丹參滴丸對糖尿病患者早期腎病損害具有明顯的保護(hù)作用,但其作用機(jī)制并不完全清楚。因此,本研究通過觀察DSP 對DM 大鼠腎臟TGF-β1/Smads 信號通路的影響,從而探討DSP 對糖尿病腎臟保護(hù)的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物 選取50 只6~8 周齡的健康清潔級、雄性Wistar 大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購于昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,室溫(24±2)℃,濕度(45±5)%,自然光照,室內(nèi)保持安靜。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

        1.1.2 主要試劑 復(fù)方丹參滴丸(天士力制藥集團(tuán)股份有限公司);鏈脲佐菌素(美國Sigma 公司);TGF-β1 兔抗大鼠一抗、重組人β 肌動蛋白(β-actin)兔抗大鼠一抗、羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);p-Smad2、p-Smad3 的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(Cell Signaling 公司);Smad7、腎損傷分子-1(KIM-1)、骨橋蛋白(OPN)的ELISA 試劑盒(武漢華美公司);RIPA 裂解液(凱基生物);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(凱基生物);PCR 引物(博士德生物);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒(Taka-Ra)。

        1.1.3 主要儀器 全自動生化分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司);血糖儀及配套試紙(三諾生物傳感股份有限公司);ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司);酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司)、電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司);數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 分組及造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,按隨機(jī)數(shù)字表法將50 只大鼠隨機(jī)分為空白對照組(NC組,n=10)、造模組(n=40)。然后造模組大鼠使用腹腔注射1%鏈脲佐菌素(60 mg/kg)進(jìn)行造模,對照組大鼠腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液(0.1 mol/L),在72 h 后尾靜脈采血,從而測定血糖濃度≥16.7 mmol/L時為造模成功[15]。

        1.2.2 造模后處置 其中大鼠成模37 只,死亡3只,成模率為92.50%。最后從中選取造模成功的30只老鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病模型組(DM組,n=10)、復(fù)方丹參滴丸低劑量組(DSP 低劑量組,n=10)、復(fù)方丹參滴丸高劑量組(DSP 高劑量組,n=10)。DSP 低、高劑量組大鼠每天分別給予200、400 mg/kg 的DSP 與生理鹽水混懸液灌胃治療,NC 組及DM 組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃,均每日1 次,持續(xù)8周。

        1.2.3 血糖、血肌酐、尿素氮檢測 實驗結(jié)束,血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖(fasting blood-glucose,F(xiàn)BG)水平。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后靜脈取血,分離血清,使用全自動生化分析儀進(jìn)行各組大鼠的血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的檢測。

        1.2.4 熒光定量PCR 法檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表達(dá)水平 取各組腎臟組織50 mg,先提取總RNA,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,最后對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。其中反應(yīng)體 系 是20 μL,反 應(yīng) 條 件 是stage1:95 ℃,30 s。stage2:95 ℃,5 s;60 ℃,34 s;40 個循環(huán)。PCR 擴(kuò)增的特異性引物序列見表1。

        表1 PCR擴(kuò)增的特異性引物序列

        1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1 的蛋白表達(dá) 取各組腎臟組織80 mg,提取總蛋白,測定其濃度,上樣等質(zhì)量的蛋白。然后電泳、進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育TGF-β1 一抗(1∶1 000)4 ℃過夜,用TBST 清洗,37 ℃孵育二抗(1∶10 000)1 h,再次用TBST 清洗,最后用ELC 發(fā)光試劑盒顯影。蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

        1.2.6 ELISA 法檢測各組大鼠尿中KIM-1、尿中OPN 以及腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7的濃度表達(dá)水平 代謝籠收集各組大鼠尿液,然后采用ELISA 試劑盒檢測各組大鼠尿中KIM-1、OPN 的濃度。取部分新鮮的腎臟組織,使用ELISA 試劑盒檢測各組大鼠腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3、Smad7的濃度表達(dá)水平。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。觀測資料均為計量數(shù)據(jù),采用x ± s 表示,組間比較采用單因素方差分析,組間方差齊用LSD法,方差不齊用Tamhane’s T2(M)檢驗。P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠血糖比較與NC組相比,DM組大鼠血糖明顯升高(P <0.05);與DM 組相比,DSP 低、高劑量組大鼠血糖明顯降低(P <0.05),且高劑量組較低劑量組有進(jìn)一步下降的趨勢。見表2。

        2.2 各組大鼠腎損傷標(biāo)志物水平的比較與NC 組相比,DM組大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN濃度明顯升高(P <0.05),提示糖尿病引起了大鼠腎臟損傷;與DM組比較,DSP低、高劑量組大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN 濃度明顯降低(P <0.05),且高劑量組尿KIM-1、尿OPN 濃度明顯低于低劑量組(P <0.05),說明DSP劑量依賴性地改善了糖尿病大鼠的腎臟損傷,對糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。見表2。

        2.3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)與NC組相比,DM組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA與蛋白表達(dá)均明顯升高(P <0.05);與DM組相比,DSP低、高劑量組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA與蛋白均明顯減低(P <0.05),且高劑量組明顯低于低劑量組(P <0.05),說明DSP劑量依賴性地抑制了糖尿病大鼠的腎臟TGF-β1表達(dá)。見表3,圖1。

        2.4 各組大鼠腎臟組織Smads 的mRNA 和蛋白表達(dá)

        2.4.1 各組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表達(dá) 與NC 組比較,DM 組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高(P <0.05),而Smad7 的mRNA 表達(dá)水平明顯降低(P <0.05);與DM 組比較,DSP 低、高劑量組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3 的mRNA 表達(dá)水平均明顯減低(P <0.05),而Smad7 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高(P <0.05);且DSP 高劑量組Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平低于DSP 低劑量組(P <0.05),Smad7 的mRNA 表達(dá)水平高于DSP 低劑量組(P <0.05)。見表4。

        表2 各組大鼠血糖及腎損傷標(biāo)志物水平的比較/x ± s

        表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)/x ± s

        圖1 各組大鼠腎臟組織的蛋白表達(dá)(n=10)

        表4 各組大鼠腎臟組織Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)/x ± s

        2.4.2 各組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7 的蛋白表達(dá) 與NC 組比較,DM 組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3 的蛋白水平明顯升高(P <0.05),而Smad7 的蛋白水平明顯降低(P <0.05);與DM 組比較,DSP 低、高劑量組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表達(dá)水平均明顯減低(P <0.05),而Smad7 的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P <0.05);且DSP 高劑量組p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表達(dá)水平低于DSP 低劑量組(P <0.05),Smad7 的蛋白表達(dá)水平高于DSP低劑量組(P <0.05)。見表5。

        表5 各組大鼠腎臟組織p-Smad2、p-Smad3、Smad7的蛋白表達(dá)/x ± s

        3 討論

        糖尿病在中醫(yī)學(xué)中被稱為“消渴”,而“糖尿病腎病”是消渴病并發(fā)癥,發(fā)于腎臟,因此呂仁和教授稱其為消渴病腎病[16]。消渴病腎病的基本病機(jī)為“腎虛血瘀”,而活血益氣法是治療此病的主要措施,并特別強(qiáng)調(diào)活血法貫穿整個治療過程[17-19]。DSP 是一種新型中藥制劑,以丹參、冰片、三七等中藥為主要成分,具有活血化瘀、行氣止痛等功效,且具有起效迅速、生物利用度高的特點(diǎn)[20]。其中丹參味苦、性微寒,是主要的活血化瘀中藥,古代醫(yī)書上有“一味丹參,功同四物(當(dāng)歸、川芍、白芍、熟地)”之說。冰片辛香而寒涼,善于開竅醒神、清熱止痛。三七味苦而甘、性溫,具有良好的活血化瘀、止血止痛的功效?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn):DSP 可改善DM 動物模型的胰島功能、降低血糖水平、緩解炎癥反應(yīng)[21]、改善DM所引起的心臟[22]、腎臟[23]等臟器的損傷,在DM 及其多種并發(fā)癥的防治上顯示了較好的療效[24-26]。

        DN 是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一[27]。當(dāng)血清Scr、BUN及尿KIM-1、OPN 等指標(biāo)出現(xiàn)異常的時候,可以提示糖尿病可能出現(xiàn)了腎病的并發(fā)癥[28-29]。在評價腎功能損傷時,尿KIM-1、尿OPN 比血肌酐、尿素氮等指標(biāo)更為敏感,因為血肌酐、尿素氮常常在腎功能嚴(yán)重下降時才會發(fā)生明顯的變化,而尿KIM-1、尿OPN水平常常在腎臟存在輕微病變時就會發(fā)生比較明顯的變化,所以可以被用來評價腎臟的早期損傷[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn):與NC 組比較,DM 組大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮濃度明顯升高,提示糖尿病大鼠模型出現(xiàn)腎臟的損傷;與DM 組比較,DSP 低、高劑量組大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮濃度明顯降低,且高劑量組大鼠尿KIM-1、OPN 濃度明顯低于低劑量組,提示DSP 劑量依賴性地改善了糖尿病大鼠的腎臟損傷,對糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

        TGF-β1是TGF-β家族中的一個核心成員,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn):若腎臟中TGFβ1 的表達(dá)水平過高,則可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長、增加細(xì)胞外基質(zhì)含量,從而引起腎臟硬化[32]。TGFβ1/Smads 信號通路作為TGF-β1 介導(dǎo)的重要信號通路,在腎臟纖維化中發(fā)揮著不可替代的作用[33-34]。其中,TGF-β1 可與TGF-β1Ⅱ型受體結(jié)合,從而激活TGF-β1Ⅰ型受體并將Smad2、Smad3蛋白磷酸化,而磷酸化的Smad2/Smad3 與Smad4 形成活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄,最終影響一些參與腎臟損傷分子的表達(dá)[35-36]。Smad7是TGF-β1信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子,主要通過與TGF-β1Ⅰ型受體結(jié)合抑制TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[37]。大量研究發(fā)現(xiàn):糖尿病模型大鼠體內(nèi)TGF-β1 水平呈高表達(dá),而Smads 信號表達(dá)異常的狀態(tài)[38]。本研究結(jié)果顯示:與NC 組相比,DM 組大鼠腎臟TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯升高;Smad2、Smad3 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高,而Smad7的mRNA表達(dá)水平明顯降低;p-Smad2、p-Smad3 的濃度明顯升高,而Smad7 的濃度明顯降低。與DM 組相比,DSP 低、高劑量組大鼠腎臟TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯降低;Smad2、Smad3 的mRNA 表 達(dá) 水 平 明 顯 降 低,p-Smad2、p-Smad3 的濃度明顯降低,且高劑量組明顯低于低劑量組;而Smad7 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高,Smad7的濃度明顯升高,且高劑組明顯高于低劑量組。提示:DSP 劑量依賴性的抑制了糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號通路的表達(dá)。

        綜上所述,DSP 可能通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路,從而延緩STZ誘發(fā)的DM大鼠腎損害。

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