李曉宇，朱保偉，趙 明，張淑敏

(1.煙臺(tái)賽澤生物技術(shù)有限公司，山東 煙臺(tái) 264000；2.山東國(guó)際生物科技園發(fā)展有限公司，山東 煙臺(tái) 264000；3.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264033)

0 前言

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)又稱內(nèi)異癥，是指在子宮以外的其他位置生長(zhǎng)了內(nèi)膜組織，由于患者病灶部位經(jīng)常性出血，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)程[1]。育齡期女性的患病率約為10%～15%[2]。當(dāng)前，EMs的發(fā)生被廣泛認(rèn)可的是經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)，但其仍無(wú)法合理地解釋非盆腔內(nèi)異位病灶的形成原因。雖然EMs已成為一個(gè)備受關(guān)注的問(wèn)題，但臨床上仍缺乏明確的診斷標(biāo)志物和比較有效的治療手段[3]?，F(xiàn)已證實(shí)，腹腔的微環(huán)境中如果長(zhǎng)期存在炎癥，有可能會(huì)引發(fā)局部免疫抑制，造成EMs的發(fā)展，這為通過(guò)消炎或調(diào)節(jié)局部免疫治療EMs提供了理論支撐。近年來(lái)，干細(xì)胞的研究為疾病治療提供了新思路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種具有高度自我更新和潛在多向分化能力的多能干細(xì)胞，參與慢性損傷修復(fù)以及損傷組織重建，同時(shí)可以調(diào)控巨噬細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)化，參與機(jī)體促炎與抗炎雙重效應(yīng)。在體外分離獲得大鼠BMSCs，將其注射于內(nèi)異癥模型鼠中，探討其對(duì)異位癥模型炎癥的調(diào)節(jié)作用，以期為內(nèi)異癥的研究和治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要材料：HE染色試劑盒(中國(guó)格凡生物公司生產(chǎn))，ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Bethyl公司生產(chǎn))，流式抗體(美國(guó)BD公司生產(chǎn))。

主要儀器：流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司生產(chǎn))，冷凍切片機(jī)(德國(guó)leica公司生產(chǎn))，熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司生產(chǎn))。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD雌性大鼠(200 g左右)30只。

1.2 大鼠BMSCs的分離與鑒定

貼壁法分離BMSCs。隨機(jī)選取5只大鼠，處死大鼠，酒精消毒，無(wú)菌下剪開(kāi)皮膚后取雙側(cè)股骨，用含雙抗的PBS中沖洗3～5次，剪掉兩端骨骺，用注射器吸取培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，吹勻重懸，過(guò)200目篩網(wǎng)，1 500 rpm離心3 min。用完全培養(yǎng)基重懸，按照細(xì)胞密度2*106個(gè)/mL鋪瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h后，棄培養(yǎng)液去除未貼壁細(xì)胞，以后每隔2～3 d換液。細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)，1∶1傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。

細(xì)胞表型鑒定。細(xì)胞傳至第3代，胰酶消化后取2*106個(gè)細(xì)胞，離心棄上清，PBS洗2遍，重懸于流式管中，加入相應(yīng)抗體和同型對(duì)照，避光孵育30 min，離心棄上清，PBS洗2遍，重懸混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.3 大鼠內(nèi)異癥模型的建立

建模前2～3 d，飼喂戊酸雌二醇片。參考Vemond 等的建模方法，自體移植建立內(nèi)異癥模型。術(shù)后第二天戊酸雌二醇飼喂，3 d一次，連續(xù)4次。建模鼠4周后剖腹觀察25只異位組織生長(zhǎng)狀況，選取建模成功且活力良好的大鼠12只并隨機(jī)分成2組。假手術(shù)組(5只)的手術(shù)方法同建模組，開(kāi)腹后結(jié)扎一側(cè)子宮角，其他相同。與建模組動(dòng)物置于同樣環(huán)境下分籠飼養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

造模成功并分組后，BMSCs組取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用生理鹽水制成密度為2*106/mL的細(xì)胞懸液，經(jīng)尾靜脈緩慢注入0.5 mL ，對(duì)照組注射等量生理鹽水。細(xì)胞移植4周后處死大鼠，并取下異位囊腫行HE染色。

1.5 血液、腹腔液和組織的取材及檢測(cè)

腹腔巨噬細(xì)胞的提取及流式檢測(cè)：處死大鼠并消毒，腹腔注射30 mL PBS，輕揉數(shù)分鐘。吸出灌洗液，300 g離心棄上清，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，300 g離心，用DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于瓶，置于培養(yǎng)箱。4 h后輕輕棄掉培養(yǎng)基，洗去未貼壁細(xì)胞，然后收集貼壁細(xì)胞，PBS洗滌2次，重懸于流式管中，加入對(duì)應(yīng)抗體，避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，先抽取100 uL腹腔液。開(kāi)腹后，腹主動(dòng)脈取5 mL血，離心后取上清液。按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè) IL-2、TNF -α蛋白濃度。

小心取下各組異位囊腫，假手術(shù)組取正常子宮內(nèi)膜組織，行HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSC的形態(tài)特征及鑒定

鏡下觀察，原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，為不規(guī)則多邊形，增殖速度較慢。傳代培養(yǎng)后第3代，細(xì)胞形態(tài)趨于均一紡錘形，后期呈旋渦狀生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)。

圖1 大鼠BMSCs形態(tài)(5×10)Fig.1 Rat BMSMs morphology(5×10)

流式分析結(jié)果顯示，大鼠 BMSC 檢測(cè)細(xì)胞表面分子HLA-DR、CD14、CD19、CD90的陽(yáng)性率分別為 0.8%、98.7%、0.2%、0.8% (見(jiàn)圖2)，結(jié)果符合國(guó)際細(xì)胞治療MSC標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定。

注：A：HLA-DR B：CD14 C：CD19 D：CD90圖2 大鼠BMSCs細(xì)胞表型鑒定Fig.2 Rat BMSCs cell phenotype identification

2.2 大鼠內(nèi)異癥模型的建立

選25只雌性SD大鼠，隨機(jī)5只為假手術(shù)組，其余20只用于建模。建模4周后，15只大鼠皮下可見(jiàn)明顯凸起。麻醉大鼠，無(wú)菌下開(kāi)腹，查看模型建立情況。在筋膜層與肌肉層形成囊泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)充滿液體，表層有新生血管，說(shuō)明建模成功(見(jiàn)圖3.D)。20只大鼠有3只死亡(2只因過(guò)度麻醉死亡，1只感染致死)，2只未成模，15只建模成功，移植成活率為75%。

注：A：結(jié)扎一側(cè)子宮 B：縱剖子宮 C：子宮內(nèi)膜縫合于腹腔壁 D：四周后開(kāi)腹圖3 大鼠內(nèi)異癥模型的建立Fig.3 Modeling construction of rat endometriosis

2.3 大鼠血液及腹腔液中的VEGF和TNF-α的表達(dá)差異

與假手術(shù)組相比，對(duì)照組的血清和腹腔液中VEGF、TNF-α的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。移植BMSCs后，與對(duì)照組相比，VEGF水平升高，TNF-α的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.4 腹腔液巨噬細(xì)胞表型的變化

BMSCs組M1型巨噬細(xì)胞(CD86+)亞群比例低于對(duì)照組，而M2型巨噬細(xì)胞(CD206+)亞群比例明顯高于對(duì)照組。

2.5 病理組織學(xué)比較

假手術(shù)組腺體結(jié)構(gòu)較多，腺上皮細(xì)胞呈柱狀(見(jiàn)圖5.A)。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組腺體數(shù)量減少并伴有纖維化，上皮細(xì)胞鋸齒狀生長(zhǎng)，結(jié)締組織較多(見(jiàn)圖5.B)。BMSCs組腺體縮小，與對(duì)照組相比，腺體和血管明顯減少，上皮層較薄，間質(zhì)細(xì)胞較少(見(jiàn)圖5.C)。

表1 血清和腹腔液中VEGF和TNF-α的含量Tab.1 VEGF and TNF-α content of serum and peritoneal fluid

注：A：假手術(shù)組 B：對(duì)照組 C：BMSC治療組 注：*表示與假手術(shù)組比較，P<0.05；#表示與對(duì)照組比較，P<0.05。圖4 腹腔液巨噬細(xì)胞表型比較Fig.4 Comparison of peritoneal fluid macrophage cell phenotype

注：A：假手術(shù)組 B：模型對(duì)照組 C：模型BMSC給藥組圖5 各組大鼠子宮內(nèi)膜的病理學(xué)組織比較Fig.5 Comparison of endometrial pathology organization of rats in two groups

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥雖不是腫瘤性疾病，但表現(xiàn)類似與惡性腫瘤，且易于復(fù)發(fā)和進(jìn)展，5年的累積復(fù)發(fā)率約為40%～50%。有研究證實(shí)，腹腔微環(huán)境中慢性炎癥的長(zhǎng)期存在可引發(fā)免疫抑制，導(dǎo)致內(nèi)異癥進(jìn)展，因此消炎或免疫調(diào)節(jié)也成為治療本病的新方向。腫瘤壞死因子-α (TNF-α)是能夠引起局部或全身炎癥反應(yīng)的因子之一，而M2型巨噬細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、精氨酸酶-1(Arg-1)和IL-10等在抑制炎癥方面起到重要作用，這些因子表達(dá)水平與內(nèi)異癥局部微環(huán)境的炎癥反應(yīng)的消除密不可分。曹佃貴等通過(guò)檢測(cè)腹腔液中VEGF、TNF-α 含量發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥與正常群體中VEGF、TNF-α 含量有很大差異，可作為內(nèi)異癥的診斷及治療突破點(diǎn)。TNF-α是由M1型巨噬細(xì)胞分泌，參與體內(nèi)急性促炎反應(yīng)，用以清除病原體和病變細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫防御功能，同時(shí)會(huì)引起組織損傷。而M2型巨噬細(xì)胞可以參與碎片清除、組織修復(fù)等，其表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗炎活性，在修復(fù)炎癥造成的組織損傷以及重建局部組織穩(wěn)態(tài)方面起到重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌多種具有調(diào)節(jié)免疫和抗炎作用的細(xì)胞因子，可用于治療免疫調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致的炎癥和免疫性相關(guān)的其他類疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以誘導(dǎo)未極化的巨噬細(xì)胞或M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化。

采用骨髓貼壁法成功分離得到高純度的大鼠BMSCs，同時(shí)采用自體移植法4周后成功建立了大鼠內(nèi)異癥模型，移植成活率為75%，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。對(duì)照組大鼠血清和腹腔液中VEGF 及TNF-α 水平較假手術(shù)組升高，這與已報(bào)道的研究一致。BMSCs移植后，異位病灶縮小，上皮細(xì)胞變薄，間質(zhì)細(xì)胞和腺體減少，說(shuō)明BMSCs移植后減緩了病灶進(jìn)程。巨噬細(xì)胞表型顯示，BMSCs組巨噬細(xì)胞較對(duì)照組高表達(dá)M2表型的表面分子CD206，說(shuō)明BMSCs移植促巨噬細(xì)胞M2型極化，進(jìn)而通過(guò)影響異位癥模型大鼠腹腔液中炎性分子VEGF及TNF-α的分泌，達(dá)到緩解或消除異位病灶中的炎癥反應(yīng)。從巨噬細(xì)胞極化和炎癥因子影響的角度對(duì)移植異體BMSCs改善EMs的局部微環(huán)境及可能的機(jī)制進(jìn)行探討，結(jié)果顯示，移植BMSCs促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，通過(guò)影響VEGF、TNF-α分泌水平來(lái)抑制異位病灶微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，可以抑制異位癥炎癥進(jìn)展，促進(jìn)局部組織修復(fù)。