余海龍，詹華奎，張嬿，畢榕

（1.西南醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院 附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610072）

0 引言

糖皮質激素作為原發(fā)性腎小球疾病的重要藥物，但應用中卻存在激素抵抗或不敏感現(xiàn)象，同時也存在副作用，如增加脂代謝紊亂,血液高凝狀態(tài)等。本研究以臨床效驗方“補腎活血祛風方”對阿霉素大鼠進行干預，探討本方對腎小球疾病治療的綜合作用，探索本方增強激素效果、減輕副作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠（Sprague Dawley）170 只，重（200±20）g，由成都達碩生物公司提供（合格證號：NO51203500001792）。

1.2 藥物及制備

補腎活血祛風方所含中藥飲片有熟地黃、山茱萸、生黃芪、丹參、炒僵蠶、蟬蛻、地龍、全蝎，夠自四川省中藥材飲片公司，制成每毫升含1.35g 生藥的藥液。鹽酸多柔比星（海正輝瑞制藥有限公司，批號：16002011）。醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥有限公司，批號：33021207）。

1.3 造模

大鼠適應性飼喂后，代謝籠收集每只大鼠24h 尿液，測定24 小時尿蛋白量，小于10mg 的標記后選用。造模：鹽酸多柔比星（阿霉素）分兩次尾靜脈注射，按重量初次用量為4mg/kg，第8 天再次注射，用量3.5mg/kg，空白組使用生理鹽水同法注射，末次注射后的第3 周末收集24 小時尿液，測定24 小時尿蛋白，大于100mg 為合格，同時隨機選取4 只大鼠采血測定血白蛋白和血脂，出現(xiàn)低白蛋白，高血脂提示造模成功。

1.4 分組及干預

設空白組，待造模成功后，隨機數(shù)字法增分模型組、潑尼松組、中藥組、中藥+潑尼松組，每組23 只（根據(jù)預實驗結果，每組預備3 只），確保分組無差異?？瞻捉M正常喂養(yǎng)，模型組蒸餾水，潑尼松組醋酸潑尼松片溶液，中藥組補腎活血祛風湯劑，中藥+潑尼松組上午給予潑尼松，下午給予中藥。湯劑用量根據(jù)大鼠體重按13.47g/kg/d 給藥，潑尼松根據(jù)體重按6mg/kg/d 給藥。各干預組每天灌胃給藥1 次。

1.5 檢測指標及方法

（1）一般情況：記錄體重、習性活動、飲水攝食、二便等。

（2）尿蛋白：第4 周末每組隨機選定10 只大鼠，代謝籠收集24 小時尿液，德國西門子公司生化分析儀（ADVIA2400）及試劑檢測24 小時蛋白尿。8 周末重復測定。

（3）血液指標：8 周末，每組隨機抽取10 只大鼠，水合氯醛400mg/kg 用量腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，用上海特康科技公司全自動生化分析儀（TC6010L）及試劑，測定血白蛋白（ALb）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）；凝血分析儀及配套試劑測定大鼠凝血酶原時間 (PT), 凝血酶時間 (TT), 部分凝血活酶時間 (APTT)。同時摘取腎臟，HE 染色觀察病理改變。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 21.0 對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用表示。滿足參數(shù)檢驗條件的組間比較選用T 檢驗，多組間用OnewayANOVA 單因素方差分析；不符合條件者用非參檢驗，組間比較用Mann-Whitney，兩兩比較選Nemenyi。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

空白組大鼠體重增長快，皮毛色澤、精神活動、攝食排便等無特殊。模型組皮毛逐漸枯槁，活動萎靡，尾部不同程度水腫或潰爛，攝食減少，體重增速減慢，部分門齒斷裂、松脫。各治療組上述癥狀相對輕，潑尼松組出現(xiàn)興奮，狂躁，部分可見腹部或肢體水腫。除空白組，其余各組均有大鼠死亡，模型組死亡2 只，潑尼松組死亡3 只，中藥組死亡2 只，中藥加潑尼松組死亡3 只。

2.2 尿蛋白情況

造模后各組24 小時尿蛋白均高于空白組（P＜0.05），造模各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示造模成功，分組具有可比性。在第4 周末時各干預組及模型組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在8 周末中藥+潑尼松組、激素組尿蛋白均低于模型組（P＜0.05），中藥+ 潑尼松組低于潑尼松組和中藥組，激素組低于中藥組，但三組間差異無統(tǒng)計學義（P＞0.05）。對不同時間和不同用藥組做交互分析，呈現(xiàn)出統(tǒng)計學差異（F=4.228,P=0.001）。

表1 24h 尿蛋白定量比較（mg/24h， ±s）

表1 24h 尿蛋白定量比較（mg/24h， ±s）

注：＊為與空白組相比，P＜0.05；△：與模型組相比，P＜0.05

組別 數(shù)量 造模后 4 周末 8 周末空白組 10 6.26±1.65 17.75±3.04 17.35±4.13模型組 10 187.99±45.84＊ 271.28±136.63＊ 502.52±217.51＊潑尼松組 10 211.12±61.60＊ 233.69±90.15＊ 296.44±114.17＊△中藥組 10 201.71±60.33＊ 294.82±100.76＊ 359.71±128.58＊中藥+潑尼松組 10 210.15±86.54＊ 250.89±134.41＊ 281.12±130.10＊△

2.3 血脂指標

空白組白蛋白高于其他組，與模型組、激素組、中藥+激組相比，P＜0.05，與中藥組相比，P＞0.05。甘油三酯：中藥組低于各干預組，且與激素和激素+中藥組比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。膽固醇：中藥組低于各干預組，且與中藥加激素組相比具有統(tǒng)計學意（P＜0.05）。

2.4 凝血指標

空白組白PT 長于其他組，P＜0.05，其余四組間比較無統(tǒng)計學差異。中藥+ 潑尼松組APTT 明顯長于其余各組，P＜0.05，其余各組間差異無統(tǒng)計學意義。空白組TT 長于其余各組（P＜0.05），潑尼松組TT 明顯低于模型組，P＜0.05，其余各組比較無統(tǒng)計學意義。

表2 8 周末TG、TC 比較( ±s)

表2 8 周末TG、TC 比較( ±s)

注：＊為與空白組相比，P＜0.05；▽表示與中藥組相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) TG（mmol/L） TC（mmol/L）空白組 10 0.29±0.14 1.01±0.29模型組 10 8.18±8.92＊ 5.62±3.68＊潑尼松組 10 13.9±10.04＊▽ 5.84±3.38＊中藥組 10 4.40±3.58＊ 5.34±2.79＊中藥+潑尼松組 10 13.29±7.50＊▽ 8.30±3.99▽＊

表3 8 周末各組大鼠凝血指標比較( ±s)

表3 8 周末各組大鼠凝血指標比較( ±s)

注：＊為與空白組相比，P＜0.05；▽為與模型組相比，P＜0.05；△為與中藥+ 潑尼松組比，P＜0.05

組別 例數(shù) PT（s） APTT（s） TT（s）空白組 10 11.64±0.63 19.52±1.46△ 29.85±4.64模型組 10 9.78±0.75＊ 19.34±1.44△ 28.27±2.54＊潑尼松組 10 10.26±1.06＊ 20.40±1.61△ 25.50±4.01＊▽中藥組 10 10.04±1.28＊ 19.28±0.88△ 27.21±7.92＊中藥+潑尼松組 10 9.93±0.38＊ 21.80±1.38 26.96±13.04＊

3 討論

補腎活血祛風方根據(jù)著名中西醫(yī)結合腎臟病專家葉傳蕙教授經(jīng)驗化裁而成，葉老在治療蛋白尿時強調祛風通絡，提出“風邪不去，蛋白不消”的觀念。風為百病之長，可兼寒夾熱，淺則襲皮毛腠理，深則入臟腑經(jīng)絡，與風、濕、熱、瘀膠滯[1]。此時祛風能起到滌蕩諸邪之效，但草木之品恐難觸及深處之邪，故選用僵蠶、全蝎、蜈蚣、蟬蛻等能搜剔入絡的蟲類藥搜風通絡，剔動深固于內的邪氣。再者，脾腎久損，易夾肝風內動，而上述藥物則又可平息內風，滌痰通絡。必要時酌情聯(lián)合使用糖皮質激素可減少尿蛋白，同時能減輕激素副作用，改善代謝[2-3]。黃淑芬教授在治療慢性腎臟疾病蛋白尿時，也重視腎絡瘀阻、玄府閉塞的病機，并且認為瘀久可生風，創(chuàng)造性的提出了“治血先治風”的理論，運用蟲類藥開通玄府，祛風通絡、活血舒絡，對慢性腎臟病尿蛋白有較好緩解[4-5]。

蛋白尿是多類腎小球疾病，尤其是腎病綜合征的典型表現(xiàn)，而這一過程又會反過來加重腎臟病變，比如觸發(fā)炎癥因子過度表達和脂代謝紊亂，或對系膜細胞和腎小管產(chǎn)生毒性。本實驗中，模型組尿蛋白增加明顯，4 周末時各干預組尿蛋白低于模型組，而潑尼松組最低，起效快，但無統(tǒng)計學意義，到8周末時潑尼松組、中藥加潑尼松明顯低于模型組，且差異有統(tǒng)計學意義，說明在一定治療周期基礎上潑尼松、和中藥加潑尼松能對尿蛋白有改善作用，遺憾的是其余各干預組之間比較并未顯示出統(tǒng)計學差異，但交互分析顯示不同時間和尿蛋白具有交互作用，說明隨著觀察時間進一步延長，可能差體現(xiàn)更明顯。也推測可能與24 小時尿蛋白受尿量影響過大有關系，有研究[6-8]表明尿蛋白/肌酐比值與尿蛋白定量有較好相關性，能反映腎臟病變，對于本模型后續(xù)研究有一定借鑒意義。另一方面，腎臟的病理改變是影響腎臟功能的關鍵因素，雖然中藥加潑尼松組尿蛋白在統(tǒng)計學上未呈現(xiàn)差異，但中藥加潑尼松組病理改變是相對輕的，這可能是本方的另一優(yōu)勢所在。

高脂血癥與系膜細胞增生，炎癥因子釋放，高凝狀態(tài)及血栓形成及腎小管間質纖維化，腎小球硬化發(fā)展有關[9-10]。本實驗除空白組，均出現(xiàn)了明顯血脂紊亂，潑尼松組、中藥加潑尼松組TG 明顯高于中藥組，說明激素的應用可能會加重TG紊亂，單用中藥不引起阿霉素大鼠TG 升高，這與某些關于僵蠶、蟬蛻、地龍等蟲類藥物對血脂作用的研究相吻合[11-13]。但本方中二者合用與單用激素相比并未顯示出統(tǒng)計學優(yōu)勢，可能是受到激素對脂代謝的過強干擾，同時也不排除與實驗后期各組動物因門齒斷裂等因素造成進食差異有關，特別是中藥加激素組動物進食情況好于激素組。

腎病綜合征常常伴有高凝狀態(tài)，這增加血栓形成及栓塞發(fā)生的風險，特別是在大量尿蛋白的情況下更突出，對患者預后有影響，所以改善高凝和防治血栓是腎病綜合征患者治療的重要內容。實驗中模型組凝血時間和空白組相比均有縮短的現(xiàn)象，符合疾病特點。各組PT 時間比較無統(tǒng)計學意義，中藥加潑尼松組APTT 高于其余各組，激素組TT 低于模型組，說明中藥不引起TT 縮短，中藥和潑尼松合用可以延長APTT，在一定程度上有利于改善高凝狀態(tài)。

所以本方在應用時可能不僅僅體現(xiàn)于改善蛋白尿，而是包括了改善脂代謝、高凝狀態(tài)在內的多項綜合效果，而這些又是腎纖維化基礎的影響因素[14]，所以這可能對于改善長期預后具有一定意義。當然本實驗也存在一些局限性，如觀察周期相對短，尿量影響大，中藥劑量未分高低組等，尚可在指標優(yōu)化、胞內藥物濃度、改善血脂紊亂等方面深入實驗和臨床研究，進一步闡明本方的作用。