段為旦,冷偉芳,劉謝緣,冷桂華,習(xí)小文，廖金賢

（1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；3.撫州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，撫州344000；4.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建廈門361021）

大豆是一年生草本植物，世界上許多國家的比較重要的豆類，根據(jù)大豆的種子和種皮可以分為飼料豆、青大豆、黃大豆、黑大豆和其他大豆[1]。大豆中富含許多優(yōu)質(zhì)蛋白，含有豐富的人體必需氨基酸[2]，同樣也是許多動物飼料中的植物蛋白原料。但大豆蛋白的分子量相當(dāng)大，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以在動物胃腸道里面經(jīng)過消化酶作用后，主要以肽的形式被吸收。大豆蛋白不但為生物體提供生長、發(fā)育所需的營養(yǎng)，還能提高其身體免疫力，促進其新陳代謝[3]。豆粕是大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)物，豆粕是制作動物飼料的主要原料，還可以用來制作糕點食品、以及化妝品和抗菌素原料。以豆粕為原料，經(jīng)過微生物發(fā)酵分解生成許多小分子物質(zhì)如多肽類等。

大豆肽是生物活性肽，在代謝調(diào)控方面具有非常重要的作用，其中一些多肽的理化性質(zhì)比大豆蛋白好，溶解性比較好，吸水性比較穩(wěn)定，基本不受PH影響，具有較好的低黏性和較高的流動性，此外，降解豆粕小分子物質(zhì)的相對分子量較小（1000KD)，容易消化吸收，其致敏性也比較低，適合食品、動物飼料、魚粉等的生產(chǎn)加工。降解豆粕在工業(yè)生產(chǎn)中主要以酶水解法和微生物發(fā)酵法為主[4][5]，微生物水解法又包括固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法，酶水解法制備的產(chǎn)品會產(chǎn)生不利于產(chǎn)品的味道，使產(chǎn)品口感差[6]。所以本試驗采用微生物發(fā)酵法中的固態(tài)發(fā)酵法，改善降解豆粕產(chǎn)生的大豆肽的品質(zhì)，提高大豆肽的產(chǎn)量，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子[7]，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，完善好豆粕發(fā)酵的工藝，來提高降解豆粕的效率，為大豆肽以及動物飼料的后續(xù)研究試驗及工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料和設(shè)備

1.1 試驗菌種

枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌、根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉為實驗室提供菌種。

1.2 試驗材料

大豆粕（粉碎過篩）、麩皮（均為市場購買）；牛血清蛋白（標(biāo)準(zhǔn)品）；葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂、硝酸銨、氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、福林酚試劑、甲醛等

1.3 主要設(shè)備

分析天平、紫外可見分光分光光度計、離心機、超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、酸度計、磁力攪拌器、全自動高溫殺菌鍋、烘箱

2 試驗方法

2.1 工藝流程

保存菌種→菌種活化→菌種擴增→接種→發(fā)酵轉(zhuǎn)化→滅活→粉碎→浸提→離心→取上清液→測可溶性蛋白含量、多肽含量、氨基酸含量

2.2 主要操作要點

2.2.1 菌種活化2.2.1.1根霉F、根霉G、里氏木霉、白腐菌種培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基)

20%馬鈴薯、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.05%氯化鎂、0.03%磷酸二氫鉀、0.03%磷酸氫二鉀，自然PH，配制成50mL培養(yǎng)基。在超凈工作臺中，將保藏在甘油管的根霉F、根霉G、里氏木霉、白腐解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中，在28℃、120r/min條件下恒溫?fù)u床中活化培養(yǎng)7d左右。

2.2.1 .2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基

1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%氯化鈉，自然PH，配制成50mL培養(yǎng)基。在超凈工作臺中，將保藏在甘油管的枯草芽孢桿菌解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中，在37℃、120r/min條件下恒溫?fù)u床中活化培養(yǎng)2d左右。

2.2.1 .3 酵母菌培養(yǎng)基

1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖，自然PH，配制成50mL培養(yǎng)基。在超凈工作臺中，將保藏在甘油管的酵母菌解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中，在37℃、120r/min條件下恒溫?fù)u床中活化培養(yǎng)2 d左右。

2.2.1 .4 乳桿菌培養(yǎng)基

乳桿菌培養(yǎng)基：5%牛肉膏、0.5%蛋白胨、0.5%酵母浸，PH調(diào)至6.8，配制成50mL培養(yǎng)基。將保藏在甘油管的酵母菌解封后分別接種到50mL培養(yǎng)基中，在37℃、120r/min條件下恒溫?fù)u床中活化培養(yǎng)2d左右。

活化結(jié)束后，枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母桿菌等菌菌液出現(xiàn)明顯渾濁，而根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉等菌液中菌體成可見團狀，菌液表面覆蓋一層白色菌膜，若菌體保存時間過久，初始活力不足，可適當(dāng)延長活化時間。

2.2.2 種子液擴增培養(yǎng)

活化和擴增的培養(yǎng)基成分一致，將裝有的種子液擴增培養(yǎng)基的錐形瓶包扎好放入高壓滅菌鍋，在121℃，0.12MPa的條件下殺菌30min。待殺菌完成后，將錐形瓶放入超凈工作臺上冷卻。溫度合適時，取適量的活化后的菌液，注入的含相適應(yīng)培養(yǎng)基的錐形瓶中，接種時注意防止染上雜菌，接種后用紗布或者牛皮紙封口，輕輕搖勻混合，放入37℃、轉(zhuǎn)速為180r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24h（根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉培養(yǎng)72h）。將擴增后的菌液作為種子液備用。

2.2.2 發(fā)酵轉(zhuǎn)化

將活化擴增好的種子液在無菌環(huán)境下接種到固體培養(yǎng)基中，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，在不同的發(fā)酵條件下，復(fù)合微生物利用自身產(chǎn)生的酶將豆粕進行降解，分解轉(zhuǎn)化成許多小分子物質(zhì)。

2.2.3 發(fā)酵液的提取

豆粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后，將發(fā)酵后的豆粕及其菌種放入100℃的烘箱進行30min加熱滅活。滅活后的豆粕用研缽進行研磨粉碎處理，處理好的樣品稱取0.5g,加入8mL蒸餾水并放入超聲器里超聲、水浴加熱65℃30min進行浸提，用振蕩機振蕩5min，倒出上層液體于離心管中，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心10min。離心后倒出上清液，取到所需的發(fā)酵液。

2.3 分析測定方法

2.3.1 水溶性蛋白、多肽的測定

2.3.1 .1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[8]

精確稱量0.0025g的牛血清蛋白，于10mL容量瓶中配制成250μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，取七只試管編號，分別取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL加入七只試管中，再加蒸餾水至1mL，然后依次加入堿性銅溶液5mL，搖勻混合，靜置10min后，加入試劑乙（福林酚試劑）0.5mL，立即混勻，于避光靜置30min，以1號管為空白，在680nm波長處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度于吸光度的關(guān)系見圖1，圖1中吸光度值為3次測試結(jié)果的平均值，其回歸方程為y=0.002x+0.0037,相關(guān)系數(shù)R2=0.9989。

2.3.1 .2 水溶性蛋白的測定[8]

將浸提好的發(fā)酵液放入離心管中于轉(zhuǎn)速10000r/min的離心機中離心10min，上清液倒出備用，準(zhǔn)確吸取1.0mL的上清液，稀釋至適合的濃度（測定吸光度值在0.2～0.8之間），在稀釋至一定濃度的試管中分別加入堿性銅溶液5mL，搖勻，靜置10min后，加入福林-酚試劑0.5mL，立即混勻，避光靜置30min，同樣以上述以1號管為空白，在680nm波長處測定吸光度，測定3次，記錄數(shù)據(jù)，取3次數(shù)據(jù)的平均值。將數(shù)據(jù)代入福林酚標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出蛋白濃度，乘以稀釋倍數(shù)算出發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的濃度，再乘以發(fā)酵液的量即得出發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的量，最后除以稱取樣品的量，可以得出樣品中蛋白質(zhì)的濃度（見圖1）。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.1 .3 多肽的測定[9]

將提取好的發(fā)酵液放入離心管中于轉(zhuǎn)速10000r/min的離心機中離心10min，上清液倒出備用，取離心好的上清液1.0mL加入30%三氯乙酸1mL，再次在轉(zhuǎn)速10000r/min離心機中離心10min，取上清液稀釋至一定濃度（測定吸光值在0.2～0.8之間），再分別加入堿性銅溶液5mL，搖勻，靜置10min后，加入福林酚試劑0.5mL，立即混勻，避光靜置30min，同樣以上述以1號管為空白，在680nm波長處測定吸光度，測定3次，記錄數(shù)據(jù)，取3次數(shù)據(jù)的平均值。將數(shù)據(jù)代入福林酚標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出多肽的濃度，乘以稀釋倍數(shù)算出發(fā)酵液中多肽的濃度，再乘以發(fā)酵液的量即得出發(fā)酵液中多肽的量，最后除以稱取樣品的量，可以得出樣品中多肽的濃度。

2.3.2 氨基酸的測定[10]

準(zhǔn)確吸取離心好的上清液1.0mL，置于200mL燒杯中，加水60mL，插入酸度計，開動磁力攪拌器，用0.05mol/LNAOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記錄用去氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)（按總酸計算公式，可以算出發(fā)酵液的總酸含量）。向上述溶液中，準(zhǔn)確加入甲醛溶液10mL，混勻。繼續(xù)用0.05mol/L NAOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，記錄用去氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，供計算氨基酸態(tài)氮含量用。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌液配比對降解豆粕的影響

采用對比試驗法，在其他條件不變的情況下，改變菌液中微生物的配比。試驗分別枯草芽孢桿菌：酵母菌、根霉F：根霉G：白腐：里氏木霉：乳酸桿菌=12：8：4：4：1：1：2和枯草芽孢桿菌：酵母菌：根霉F:根霉G=6：2：1：1為條件，待發(fā)酵完成后，對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較，得出試驗結(jié)果，試驗結(jié)果見表1：

表1 菌液配比對降解豆粕的影響

由表1的試驗結(jié)果表明，在其他條件不變的情況下，菌液配比對產(chǎn)生大豆肽的影響不同。數(shù)據(jù)顯示，在枯草芽孢桿菌：酵母菌：根霉F：根霉G=6：2：1：1發(fā)酵條件下多肽含量更高，所以試驗結(jié)果得出枯草芽孢桿菌：酵母菌：根霉F：根霉G:=6：2：1：1更有利于降解豆粕。

3.2 復(fù)合微生物菌液接種量對降解豆粕的影響

采用對比試驗法，在其他試驗條件不變的情況下，改變復(fù)合微生物菌液接種量。試驗分別以復(fù)合微生物菌液接種量0mL、12mL、15mL、18mL為條件，待發(fā)酵完成后，對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較，得出試驗結(jié)果，試驗結(jié)果見表2：

表2 復(fù)合微生物菌液接種量對降解豆粕的影響

由表2的試驗結(jié)果表明：復(fù)合微生物菌液接種量對降解豆粕的影響不同。在一定范圍內(nèi)，隨著菌液接種量的增多，多肽含量也隨之增加，但培養(yǎng)基能夠提供的營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間是有限的，超過一定的范圍并不會增加多肽的含量。在其他條件相同的情況下，與空白組多肽量為29.902mg/g相比較，接種量18mL組多肽量增加了66.179mg/g。接種量18mL時多肽含量最高。根據(jù)試驗結(jié)果得出接種量在18mL時為較優(yōu)條件。

3.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分含量對豆粕降解的影響

采用對比試驗法，改變固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的固液比。試驗分別以固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的固液比（固態(tài)：液態(tài)）：1：0.8、1：1.0、1：1.2、1：1.4，1：1.6為條件，待發(fā)酵完成后，對可溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較，得出試驗結(jié)果。以下為試驗結(jié)果，見圖2：

圖2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分含量對豆粕降解的影響

水分含量對固態(tài)發(fā)酵有著重要影響，水分含量的高低影響培養(yǎng)基的透氣性，從而影響發(fā)酵菌種的生長。由圖2的數(shù)據(jù)變化趨勢表明：隨著固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分含量的增多，可溶性蛋白和多肽含量先增加后減少，培養(yǎng)基中的固液比（固態(tài)：液態(tài)）為1：1.2時可溶性蛋白和多肽含量最高。所以根據(jù)試驗結(jié)果可得出固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分含量固液比（固態(tài)：液態(tài)）在1：1.2時為較優(yōu)發(fā)酵條件。

3.4 發(fā)酵溫度對豆粕降解的影響

采用單因素試驗法，在其他條件不變的情況下，改變豆粕發(fā)酵的溫度。試驗分別以發(fā)酵溫度28℃、31℃、34℃、37℃為條件，待發(fā)酵完成后，對可溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較，得出試驗結(jié)果，試驗結(jié)果見圖3：

圖3 發(fā)酵溫度對豆粕降解的影響

由圖3的變化趨勢可知：發(fā)酵溫度在28℃～37℃時多肽和可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢，隨著發(fā)酵溫度的升高，可溶性蛋白和多肽含量增加，發(fā)酵溫度為37℃時達(dá)到最高，這可能是因為菌種的生長對溫度要求較高。所以根據(jù)試驗結(jié)果可得出發(fā)酵溫度37℃為較優(yōu)發(fā)酵條件。

3.5 發(fā)酵時間對降解豆粕的影響

采用對比試驗法，在其他條件不變的情況下，改變豆粕發(fā)酵的時間。試驗分別以發(fā)酵時間6d、8d、10d、12d為條件，待發(fā)酵完成后，對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較，得出試 驗結(jié)果，試驗結(jié)果見圖4：

圖4 發(fā)酵時間對降解豆粕的影響

由圖4的試驗結(jié)果表明：豆粕的發(fā)酵時間長短對降解豆粕的影響不同。隨著發(fā)酵時間的增長，多肽含量也隨之增加，發(fā)酵12 d的多肽含量最高。根據(jù)試驗結(jié)果得出發(fā)酵時間為12 d時為較優(yōu)條件。

3.6 是否密封對降解豆粕的影響

采用對比試驗法，在其他條件不變的情況下，使發(fā)酵環(huán)境處于密封條件。試驗分別以密封和不密封為條件，待發(fā)酵完成后，對水溶性蛋白、多肽、氨基酸的含量進行測定比較，得出試驗結(jié)果，試驗結(jié)果見表3：

表3 是否密封對降解豆粕的影響

由表3的試驗結(jié)果表明：在其他條件不變的情況下，豆粕是否密封對降解豆粕的影響不同。數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵條件在不密封的條件下多肽含量更高，所以試驗結(jié)果得出復(fù)合微生物更適合于不密封發(fā)酵。

4 結(jié)論

經(jīng)綜合分析總結(jié)試驗結(jié)果可知：復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵豆粕制備大豆肽較好的發(fā)酵條件為菌體的配比為枯草芽孢桿菌：酵母菌：根霉F：根霉G:=6：2：1：1，菌液接種量18 mL；培養(yǎng)基中的固液比（固態(tài)：液態(tài)）為1：1.2；發(fā)酵溫度37℃；發(fā)酵時間12 d；不密封的環(huán)境。