張鎮(zhèn)川，何 冰，李 甜，靳亞忠，耿雪青*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.西寧市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，西寧 810016；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

番茄（Solanum lycopersicum）是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的蔬菜作物。番茄病害會嚴重影響番茄果實的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。番茄細菌性斑點病是一種嚴重的細菌性病害，主要危害番茄植株的葉片、莖和果實，造成5%～75%的減產(chǎn)，同時影響果實的外觀[1]。近年來，我國廣西等地有該病害爆發(fā)的報道，發(fā)病率高達80%[2]。鑒于其嚴重的危害性，該病害已被列入我國的出入境檢疫有害生物名錄[1]。

丁香假單胞菌番茄致病變種Pseudomonas syringae pv.tomato是番茄細菌性斑點病的致病菌，冠菌素（coronatine，COR）是其分泌的一種化合物[3]。黃化癥狀是番茄細菌性斑點病發(fā)展后期的典型病狀，外源COR處理能夠誘導(dǎo)番茄葉片變黃，表明COR作為致病因子在病害發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。COR的分子式為C18H25NO4，由冠烷酸（CMA）和冠菌酸（CFA）通過酰胺鍵縮合而得[5]。冠烷酸與乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸酯（ACC）結(jié)構(gòu)類似，而冠菌酸與茉莉酸（JA）結(jié)構(gòu)相似[6]。COR與茉莉酸異亮氨酸（JA-Ile），都能與宿主細胞上的茉莉酸受體蛋白COI1特異結(jié)合[7]。

植物內(nèi)源激素在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，乙烯[8]、茉莉酸[9]和水楊酸[10]是參與植物防御的關(guān)鍵激素。乙烯和茉莉酸在抵抗死體營養(yǎng)病原體上發(fā)揮著協(xié)同作用，而水楊酸主要介導(dǎo)植物抵抗半活體營養(yǎng)病原菌和活體營養(yǎng)病原體的防御反應(yīng)[11]。EIN2是一種跨膜蛋白，其半衰期很短，是乙烯信號通路的正調(diào)節(jié)因子[12]。EIN3也是乙烯信號通路的正調(diào)節(jié)因子，定位于細胞核中，是EIN2的下游調(diào)節(jié)蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子激活乙烯響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[13]。脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）催化亞麻酸氧化生成13-氫過氧化亞麻酸，該反應(yīng)是茉莉酸生物合成的第一步反應(yīng)，因此LOX對于茉莉酸的生物合成至關(guān)重要，其編碼基因LoxD常被作為茉莉酸通路標(biāo)記基因[14]。MYC2轉(zhuǎn)錄因子是茉莉酸信號通路的重要蛋白，能夠激活茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑[15]。病程相關(guān)蛋白PR1a由水楊酸誘導(dǎo)產(chǎn)生，被用作水楊酸信號通路的標(biāo)記蛋白[16]。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，木質(zhì)素、酚類、黃酮類等多種次級代謝產(chǎn)物是通過苯丙烷代謝途徑生成的，這些次級代謝產(chǎn)物在植物防御中發(fā)揮著重要作用，因此PAL是植物體內(nèi)的重要防御酶[17]。

植物葉片是病原細菌危害植物的主要組織，細菌生長能力測定可以反映不同菌株在植物組織中的寄生能力，進而判斷菌株的毒性[3]。植物在病原菌入侵時會激活自身的防御反應(yīng)，胼胝質(zhì)介導(dǎo)的細胞壁增強是一種常見的基礎(chǔ)防御。接種病原細菌到葉片中數(shù)小時后，可以在接種葉片的細胞壁和細胞膜之間觀測到胼胝質(zhì)沉積[18]。

目前國內(nèi)外對COR的研究主要集中在模式植物擬南芥上，而COR在番茄植株上的生理功能及其在細菌致病過程中發(fā)揮的作用還不是很清楚。本試驗通過RT-qPCR技術(shù)測定不同濃度COR處理之后的番茄葉片的防御基因表達量，揭示了不同濃度下COR的生理功能；通過細菌生長曲線和胼胝質(zhì)沉積數(shù)量的測定，并結(jié)合基因表達量的分析結(jié)果，證明了丁香假單胞菌分泌的COR能夠促進細菌的毒性，初步探索了COR促進病原菌毒性增強的機理，為番茄細菌病害防控提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

①植物：以感病番茄品種“Money maker”為試驗材料，種子來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所饋贈。

②菌株：野生型致病菌P.syringae pv.tomato DC3000（以下簡稱Pto）和不能產(chǎn)生COR的突變體cor-，以上菌株均來源于美國俄亥俄州立大學(xué)Dr.Daivd Mackey實驗室饋贈。Pto菌株攜帶利福平抗性，cor-菌株攜帶利福平抗性和卡那霉素抗性。

③試劑：冠菌素（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；Trizol試劑（上海厚凱生物科技有限公司）；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（日本寶生物公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本寶生物公司）；苯胺藍（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（上海泰坦科技股份有限公司）；乳酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；配置KB培養(yǎng)基試劑：蛋白胨、磷酸氫二鉀、甘油和硫酸鎂（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（上海泰坦科技股份有限公司）；氯化鎂（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；利福平（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；卡那霉素（上海賢鼎生物科技有限公司）。

1.2 植物和細菌培養(yǎng)

將番茄種子于55℃水浴中浸泡催芽，待種子出芽之后播種至穴盤中，將草炭∶蛭石∶珍珠巖以3∶1∶1的比例均勻混合為培養(yǎng)基質(zhì)。將穴盤放于恒溫光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25℃恒溫光照12 h，18℃恒溫黑暗12 h。待幼苗長至2葉1心后，移苗至盆中放于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。幼苗長至5葉1心后選取長勢相當(dāng)?shù)慕】抵仓暧糜谠囼灐?/p>

將Pto接種至含有利福平（50 μg/mL）的KB固體培養(yǎng)基中；將cor-接種至含有卡那霉素（100 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的KB固體培養(yǎng)基中。平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14～16 h。

1.3 番茄葉片的COR處理

將 COR溶解配置為 1 μmol/L（高濃度）、0.1 μmol/L（較高濃度）、0.01 μmol/L（較低濃度）、0.001 μmol/L（低濃度）4個濃度的COR溶液，選取第3、4片復(fù)葉中較大的5片小葉進行處理，用1 mL無菌注射器（去注射器針頭）將不同濃度COR溶液注射進番茄葉片中，每片小葉注射溶液量約為1 mL，以去離子水作為對照組，每個組至少處理15片小葉。24 h后取樣，用液氮速凍葉片之后存放于-80℃冰箱中用于后續(xù)實驗。

1.4 基因表達差異分析

將COR處理后的番茄葉片于液氮中研磨至粉末狀，取100 mg混合均勻的樣品，采用 Trizol法提取總RNA[19]。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用Primer 5設(shè)計7對引物（表1），測定不同處理下葉片中的 PR1a、LoxD、MYC2、EIN2、EIN3和PAL5基因的相對表達量，以番茄Actin基因作為內(nèi)參基因。在CFX96實時熒光定量分析儀（Bio-Rad上海有限公司）上進行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s，反應(yīng)循環(huán)“95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s”，共設(shè)置40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量[20]。本次試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 細菌生長能力測定

用10 mmol/L MgCl2溶液將KB固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)的細菌菌落重懸，稀釋菌液直至OD600=0.2。將OD600=0.2的菌液（濃度為1×108CFU/mL）稀釋1 000倍，用1 mL無菌注射器注射菌液到葉片中，每片小葉注射菌液量約為1 mL，72 h后用打孔器隨機在接種過細菌的葉片上打孔取樣，每個處理取9個葉圓片，用研磨儀研磨葉片，梯度稀釋菌液之后取10 μL菌液滴于KB固體培養(yǎng)基上，待菌液自然揮發(fā)之后倒置于28℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)48 h。選取 CFU（Colony-Forming Units）在 20～100 范圍內(nèi)的梯度進行計數(shù)，每個梯度至少3次計數(shù)后取平均值計數(shù)。本實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 胼胝質(zhì)沉積分析

用1 mL無菌注射器注射OD600=0.2的菌液到葉片中，每片小葉注射菌液量約為1 mL，以10 mmol/LMgCl2溶液作為對照。以水∶甘油∶苯酚∶乳酸∶乙醇=1∶1∶1∶1∶2 的體積比配置脫色液，胼胝質(zhì)是一種相對較晚的植物防御指標(biāo)，在接種細菌到葉片15 h后能夠在葉片中被觀測到，我們將處理15 h后的葉片浸沒在脫色液中過夜脫色。用去離子水和50%乙醇交替沖洗葉片3次，采用0.01%水溶性苯胺藍將葉片胼胝質(zhì)染色，染色時間為30 min。染色結(jié)束后用去離子水洗去葉片上的染液，移到載玻片后制成葉片標(biāo)本放于熒光顯微鏡紫外波長下觀察，保存圖像。采用Image J軟件統(tǒng)計胼胝質(zhì)沉積數(shù)量。每個處理組取至少取5片葉片進行觀察，每片葉片至少選取3個不同視野區(qū)域進行統(tǒng)計。本實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 RT-qPCR分析引物Table 1 Primers used in RT-qPCR analysis

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistic 20進行差異顯著分析，采用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COR處理番茄葉片后基因表達分析

2.1.1 乙烯信號途徑相關(guān)基因的相對表達量

從圖1中可以看出，所有處理組中的EIN2基因和EIN3基因的表達量均顯著高于對照組。對于EIN2基因來說，各處理組中表達量最高的為1 μmol/L組，相對表達量最低的為 0.001 μmol/L 組，1 μmol/L 組的表達量顯著高于 0.1 μmol/L組，0.01 μmol/L組，和 0.001 μmol/L 組。0.1 μmol/L 組，0.01 μmol/L 組和0.001 μmol/L濃度的COR誘導(dǎo)EIN2沒有顯著差異。與EIN2基因表達類似，EIN3基因相對表達量最高的處理組為1 μmol/L組，顯著高于其他3個處理組，表明COR在高濃度時對EIN2基因和EIN3基因具有較強的誘導(dǎo)作用。

圖1 不同濃度COR處理下乙烯相關(guān)基因的表達水平Figure 1 The expression level of ethylene-related genes under different COR concentration of treatment

2.1.2 茉莉酸合成和信號途徑相關(guān)基因的相對表達量

從圖2可以看出，除0.1 μmol/L外，其他處理組中的LoxD基因和MYC2基因的表達量均與對照組差異顯著，且同一處理組中兩個基因的變化趨勢相同。1 μmol/L COR處理組中的LoxD基因和MYC2基因的表達量顯著高于對照組，表明高濃度COR能夠誘導(dǎo)番茄葉片表達LoxD基因和MYC2基因。0.01 μmol/L COR 處理組和 0.001 μmol/L COR 處理組中的LoxD基因和MYC2基因的表達量顯著低于對照組，表明低濃度和較低濃度COR處理抑制了番茄葉片LoxD基因和MYC2基因的表達。

圖2 不同濃度COR處理下茉莉酸相關(guān)基因的表達水平Figure 2 The expression level of jasmonic acid-related genes under different COR concentration of treatment

2.1.3 PR1a基因的相對表達量

從圖3中可以看出，除1 μmol/L處理組外，其余各處理組PR1a基因的表達量均低于對照組，其他處理組與對照組間差異顯著，0.1 μmol/L處理組分別與0.01 μmol/L和0.001 μmol/L處理組均無明顯差異，而0.01 μmol/L和0.001 μmol/L處理組差異顯著，整體來說COR能夠抑制葉片PR1a基因的表達。0.01 μmol/L處理組的PR1a基因表達量在4個處理組中最低，僅為1 μmol/L處理組的0.24倍，較低濃度COR對PR1a基因表達的抑制作用最強。

圖3 不同濃度COR處理下PR1a基因的表達水平Figure 3 The expression level of PR1a gene under different COR concertation of treatment

2.1.4 PAL5基因的相對表達量

從圖4中可以看出，各濃度COR處理番茄葉片均能誘導(dǎo) PAL5 基因的表達。1、0.1、0.01、0.001 μmol/L處理組的PAL5基因平均相對表達量分別為307.11、241.76、169.35 和 171.39。0.1 μmol/L 處理組分別與1 μmol/L和0.01 μmol/L處理組之間無明顯差異，0.01 μmol/L 處理組和 0.001 μmol/L 處理組無明顯差異?？偟膩碚f，隨著COR濃度的增高，PAL5基因的表達量呈上升趨勢。

圖4 不同濃度COR處理下PAL5基因的表達水平Figure 4 The expression level of PAL5 gene under different COR concertation of treatment

2.2 細菌生長能力測定

從圖5中可以看出，野生型菌株P(guān)to在番茄葉片中的生長能力極顯著高于COR缺失突變體cor-。同一接種濃度下接種不同菌株72 h后，葉片中Pto的種群密度為7.32×107CFU/cm2，cor-的種群密度為1.44×107CFU/cm2，Pto的種群密度約為cor-的5倍，表明病原菌不能分泌冠菌素后，病原菌的生長量明顯減少，說明COR能夠促進病原菌在宿主植物中的生長。

圖5 不同菌株生長能力測定Figure 5 Determination of growth ability of different strains

2.3 胼胝質(zhì)沉積分析

胼胝質(zhì)是植物抵御病原菌入侵的物理屏障。從圖6中可以看出，處理組誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積數(shù)量極顯著高于對照組，同時Pto處理組的胼胝質(zhì)沉積數(shù)量極顯著低于cor-處理組。熒光染色葉片觀測結(jié)果表明，接種細菌之后，番茄葉片啟動誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積的基礎(chǔ)防御，而COR促進細菌一定程度上抑制胼胝質(zhì)沉積，從而抑制植物防御。

圖6 不同處理誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積Figure 6 Callose depositions induced by different treatments

3 討論與結(jié)論

COR是P.syringae pv.tomato分泌的一種化合物，其分子結(jié)構(gòu)同茉莉酸衍生物茉莉酸異亮氨酸極其相似。茉莉酸異亮氨酸是植物激素茉莉酸的生物活性物質(zhì)，茉莉酸以茉莉酸異亮氨酸的活性形式同受體蛋白COI結(jié)合從而激活茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[7]。COR是病原菌分泌的毒性因子，作為茉莉酸異亮氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，在番茄中與受體蛋白COI1的親和力高于茉莉酸異亮氨酸，在植物激素途徑中發(fā)揮著與茉莉酸相似的調(diào)節(jié)作用[4，7]。Uppalapati等[4]對冠菌素、冠烷酸、冠菌酸和茉莉酸甲酯的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)COR相較于冠菌酸和冠烷酸具有更強的生物活性，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)基因中有大約40%的基因也能被COR誘導(dǎo)表達。

本試驗利用RT-qPCR技術(shù)測得不同濃度COR處理條件下茉莉酸、水楊酸、乙烯相關(guān)基因以及PAL5的相對表達量。對于茉莉酸相關(guān)基因來說，不同的COR注射濃度會呈現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用，高濃度的COR處理上調(diào)表達了MYC2基因和LoxD基因，低濃度和較低濃度的COR處理會導(dǎo)致番茄葉片MYC2基因和LoxD基因的下調(diào)表達。在健康的植物中存在著低水平的茉莉酸，這些茉莉酸能夠誘導(dǎo)JAZ阻遏蛋白的表達，而JAZ蛋白能夠抑制下游的茉莉酸信號通路[21]。因此，低濃度COR可能誘導(dǎo)了茉莉酸的負反饋調(diào)節(jié)，從而下調(diào)表達了MYC2基因和LoxD基因。PAL是一種重要的植物防御酶，在本試驗中，PAL5基因的表達量在各濃度COR處理的誘導(dǎo)下顯著提高，表明COR具有誘導(dǎo)PAL表達的生理功能。外源茉莉酸甲酯施用到植株上能夠誘導(dǎo)LjPAL1基因的表達[22]。PAL活性同內(nèi)源茉莉酸水平呈顯著正相關(guān)，高活性PAL的植株對死體營養(yǎng)菌尖刀鐮孢菌的抗性增強[23]。因此，高濃度COR對PAL5基因的誘導(dǎo)作用可能來源于COR誘導(dǎo)的茉莉酸信號通路。但在低濃度和較低濃度時，COR在抑制了茉莉酸相關(guān)基因的表達的同時誘導(dǎo)PAL5基因的大量表達，說明COR對PAL5基因的誘導(dǎo)作用存在不依賴于茉莉酸途徑的其他作用途徑。本試驗中，各濃度COR處理均導(dǎo)致了番茄葉片中PR1a基因的下調(diào)表達，而誘導(dǎo)了EIN2基因和EIN3基因的表達，表明COR具有抑制番茄體內(nèi)水楊酸信號途徑和激活乙烯信號途徑的功能。

植物在逆境條件下激活激素介導(dǎo)的防御反應(yīng)是極其耗能的，為了避免過量的防御轉(zhuǎn)錄反應(yīng)影響自身的營養(yǎng)生長，植物在識別出不同的病原體后會采用一種特定的防御途徑[24]。不同激素信號通路之間的相互交叉作用為植物平衡生長和防御的能量分配提供了可能性。通常情況下，茉莉酸和乙烯信號途徑通過MYC2和EIN3協(xié)同誘導(dǎo)下游防御基因PDF1.2的表達，增強植物對死體營養(yǎng)病原菌的抵抗性，而水楊酸則介導(dǎo)對活體營養(yǎng)和半活體營養(yǎng)病原菌的廣譜抗性[25]。茉莉酸信號通路和水楊酸信號通路之間主要表現(xiàn)出拮抗作用。MYC2轉(zhuǎn)錄因子能夠與NAC轉(zhuǎn)錄因子的啟動子結(jié)合，激活NAC轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因抑制了水楊酸生物合成相關(guān)酶ICS的表達，同時上調(diào)表達了能夠誘導(dǎo)水楊酸失活的苯甲酸/水楊酸羧甲基轉(zhuǎn)移成酶的表達，進而抑制水楊酸的合成和積累[26]。丁香假單胞菌是一種半活體營養(yǎng)病原菌，植物對丁香假單胞菌的防御反應(yīng)依靠水楊酸信號通路。S.Panchal等[27]比較了夜間環(huán)境下Pto處理葉片和外源COR處理葉片的氣孔開口寬度差異，發(fā)現(xiàn)Pto分泌的COR與1.5μmol/L濃度外源COR處理誘導(dǎo)的氣孔開口寬度相當(dāng)，由此可以假設(shè)細菌侵染過程中產(chǎn)生的COR生物濃度為1.5 μmol/L，該濃度與本次試驗中的高濃度梯度相當(dāng)。本研究結(jié)果表明高濃度COR能夠激活乙烯和茉莉酸信號通路相關(guān)基因的表達而抑制水楊酸信號途徑相關(guān)基因的表達，因此，推測在丁香假單胞菌侵染過程中，細菌通過分泌高濃度的COR劫持乙烯/茉莉酸途徑，進而削弱依賴于水楊酸的植物防御反應(yīng)。

分別接種Pto和cor-到番茄葉片中，一定時間后取樣檢測番茄葉片中的細菌生長，結(jié)果顯示能夠分泌冠菌素的野生型菌株P(guān)to在葉片中的生長能力遠強于不能分泌冠菌素的突變株cor-，表明COR增強了細菌在葉片中的寄生能力，從而增強了細菌致病性。胼胝質(zhì)是一種無定型的高分子量β-1,3-葡萄糖聚合物，能夠在病原體侵染早期在入侵部位沉積，形成有效的物理屏障，增強植物的細胞壁防御[28]。通常認為，胼胝質(zhì)沉積是由病原體相關(guān)分子模式觸發(fā)引起的植物防御，用純化的丁香假單胞菌鞭毛蛋白的保守肽flg22處理葉片可以誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積[29]。病菌通過一些效應(yīng)蛋白因子作用于宿主植物，能夠抑制胼胝質(zhì)沉積，比如flg22激活的胼胝質(zhì)沉積就受到丁香假單胞菌分泌的效應(yīng)蛋白的抑制[29]。本試驗中的胼胝質(zhì)染色觀測結(jié)果顯示，相較于對照處理，野生型菌株P(guān)to和突變株cor-均能顯著誘導(dǎo)番茄葉片的胼胝質(zhì)沉積，但Pto誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積數(shù)量顯著少于cor-誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積，表明COR也能夠抑制植物胼胝質(zhì)沉積。

綜上，本研究揭示不同濃度COR對番茄葉片防御基因的調(diào)節(jié)作用，各濃度的COR處理均能激活乙烯信號傳導(dǎo)途徑，且高濃度時這種誘導(dǎo)效應(yīng)最強；COR處理激活了PAL5基因的表達，抑制了PR1a基因的表達；COR在高濃度時會促進番茄茉莉酸合成和信號傳導(dǎo)，而在低濃度時抑制茉莉酸相關(guān)基因的表達。本研究結(jié)果證明了COR在丁香假單胞菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。一方面，細菌可能通過分泌高濃度的COR，促進了乙烯/茉莉酸途徑，以此拮抗水楊酸途徑；另一方面，細菌分泌的COR能夠顯著減少葉片中的胼胝質(zhì)沉積數(shù)量。因此，COR作為一種毒性因子促進細菌削弱了宿主防御，從而促進病原菌的生長。