靳立振，趙永華，于巧青

作者單位：廊坊市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河北 廊坊065000

肺纖維化是一種肺間質(zhì)性疾病，研究顯示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）是引發(fā)肺纖維化的主要原因，EMT 發(fā)生過程涉及轉(zhuǎn)化因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）等多種細胞因子，TGFβ1 可通過誘導EMT 發(fā)生從而促進肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，同時可通過抑制蛋白水解酶生成而促使細胞外基質(zhì)沉積從而引發(fā)肺纖維化。研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在TGFβ1 干預后的肺泡上皮A549 細胞中表達異常，并可能參與肺纖維化形成過程。因而探尋新型miRNA 分子并探究其在肺纖維化形成過程中的作用機制具有重要意義。研究表明微小RNA-212（microRNA-212，miR-212）表達異常與炎癥反應、免疫缺陷疾病及慢性腎病等相關疾病發(fā)生發(fā)展密切相關。miR-212 還可促進二氧化硅（SiO）誘導的EMT 過程。但miR-212 在肺纖維化發(fā)生過程中的作用機制尚未可知。Targetscan 預測顯示TOB2 可能是miR-212 的靶基因，TOB2 過表達可抑制肺上皮細胞EMT 過程及遷移能力。但miR-212是否可通過調(diào)控TOB2 表達從而參與肺纖維化過程尚未可知。本研究自2018 年3 月至2019 年3 月在TGFβ1 干預A549 細胞中檢測miR-212、TOB2 的表達變化，初步分析其在肺纖維化發(fā)生過程中的可能作用，為進一步探討肺纖維化形成機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺泡上皮A549 細胞（美國ATCC 公司）。TGFβ1（美國PeproTech 公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（均為美國Hyclone 公司）；Lipofectamine2000（美國Thermo Fisher公司）；miR-212 抑制劑（anti-miR-212）及其陰性對照（anti-miR-con）、miR-212 模擬物（mimics）及陰性對照mimic NC 序列（miR-con）、TOB2 小干擾RNA（si-TOB2）及無意義序列（si-con）（均為上海吉瑪制藥技術有限公司）；甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）（上海澤葉生物科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因載體（美國Promega 公司）及活性檢測試劑盒（美國Promega 公司）；細胞周期蛋白1（CyclinD1）（美國Santa Cruz 公司）、TOB2 單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋a1（COL1a1）、上皮鈣黏附素（E-cadherin）（均為美國Epitomics 公司）；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒（均為大連寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞來源及培養(yǎng)條件 人肺泡上皮A549 細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分數(shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱，待細胞生長融合度達到70%時用不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理24 h。

1.2.2 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法分成6組：PBS組（用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1 組（含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+anti-miR-con組（轉(zhuǎn)染anti-miR-con 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+anti-miR-212 組（轉(zhuǎn)染antimiR-212 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+ anti-miR-212+si-con 組（共 轉(zhuǎn) 染antimiR-212 與si-con 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）、TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2 組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-212與si-TOB2后使用含有5 ng/mLTGFβ 1培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h）。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞中miR-212、TOB2 mRNA 表達水平 采用Trizol 法提取各組細胞總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計測定RNA 濃度，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見表1。配置qRT-PCR 反應體系，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，反應條件：95 ℃2 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)40 次，miR-212 以U6 為內(nèi)參，TOB2以β-actin 為內(nèi)參，采用2法計算miR-212、TOB2 mRNA相對表達量。

1.2.4 MTT 檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期A549細胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞濃度為5×10個/毫升，接種于96 孔板（100 微升/孔），置于溫度37 ℃、相對濕度95%、體積分數(shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，棄按照“1.2.1”處理，每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻，利用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度（OD）值，細胞增殖率（%）= 實驗組/空白組×100%。

1.2.5 熒光素酶報告基因檢測 將熒光素酶報告載體WT- TOB2、MUT- TOB2 分別與miR-212 mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染A549 細胞，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細胞，根據(jù)熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細胞相對熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值）。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測CyclinD1、Vimentin、α-SMA、COL1a1、E-cadherin 蛋 白 表 達收集各組細胞，加入蛋白裂解液，4 ℃條件下12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min（離心半徑6 cm）提取細胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，蛋白上樣量30微克/孔，轉(zhuǎn)膜，BSA 封閉1 h，加入蛋白一抗，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL 顯色，曝光，顯影，采用Quantity One 軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。結果均為正態(tài)計量資料，以x ± s 表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TGF-

β

1 對A549 細胞中的miR

-

212 和TOB2表達的影響

實驗結果顯示，相較于PBS組，TGFβ1組A549 細胞中miR-212 的表達水平顯著升高（P ＜0.05），而TOB2 mRNA 及蛋白表達水平顯著降低（P ＜0.05），見表2。

表2 TGFβ1對A549細胞中miR-212和TOB2的表達（n=9）/x ± s

2.2 干擾miR-212 抑制TGF

β

1 誘導A549 細胞增殖的影響

與PBS組相比，TGFβ1組A549細胞增殖率顯著升高（P ＜0.05），細胞增殖相關蛋白CyclinD1的表達水平顯著升高（P ＜0.05）；相較于TGFβ1+antimiR-con 組，TGFβ1+anti-miR-212 組A549 細胞增殖率顯著降低（P ＜0.05），細胞增殖相關蛋白CyclinD1蛋白表達水平顯著降低（P ＜0.05），見表3。

表3 干擾miR-212抑制TGFβ1誘導A549細胞增殖和CyclinD1的表達（n=9）/x ± s

2.3 干 擾miR-212 抑 制TGF

β

1 誘 導A549 細 胞EMT 和COL1a1 蛋白表達

與PBS 組相比，TGFβ1組A549 細胞中EMT 間質(zhì)細胞標志物Vimentin、α-SMA、及纖維化標記蛋白COL1a1 的表達水平均顯著升高（P ＜0.05），EMT 上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達水平顯著降低（P ＜0.05）；與TGFβ1+antimiR-con 組相比，TGFβ1+anti-miR-212 組A549 細胞中EMT 間質(zhì)細胞標志物Vimentin、α-SMA 及纖維化標記蛋白COL1a1 的表達水平均顯著降低（P ＜0.05），EMT 上皮細胞標志物E-cadherin 蛋白表達水平顯著升高（P ＜0.05），見圖1、表4。

圖1 檢測A549細胞中E-cadherin、Vimentin、α-SMA和COL1a1蛋白表達

2.4 miR-212 靶 向 調(diào) 控TOB2 表 達

Targetscan預測到miR-212 靶向TOB2。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TOB2 的miR-212 組熒光素酶活性顯著低于miR-con 組（P ＜0.05），共轉(zhuǎn)染MUT-TOB2 的miR-212 組與miR-con 組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義，見表5。Western blot 檢測結果顯示，與miR-con 組相比，miR-212 組A549 細胞中TOB2 蛋白表達水平顯著降低（P ＜0.05）；與anti-miR-con 組相比，antimiR-212 組A549 細胞中TOB2 蛋白表達水平顯著升高（P ＜0.05），見圖2、表6。

圖2 蛋白免疫印跡檢測結果

2.5 下 調(diào)TOB2 和 干 擾miR

-

212 對TGF

β

1 誘 導A549細胞增殖、EMT和纖維化的影響

相較于TGFβ 1+ anti-miR-212+si-con 組，TGFβ1+ anti-miR-212+si-TOB2組A549細胞增殖率顯著升高（P ＜0.05），細胞增殖相關蛋白CyclinD1與EMT間質(zhì)細胞標志物Vimentin、α-SMA及纖維化標記蛋白COL1a1的表達水平顯著升高（P ＜0.05），EMT上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達水平顯著降低（P ＜0.05），見圖3，表7。

3 討論

肺纖維化發(fā)病機制尚未完全闡明，但研究報道指出遺傳因素與氧化應激等可能引發(fā)肺纖維化，其主要病理特點為肺泡上皮細胞損傷與修復處于失衡狀態(tài)導致肺功能逐漸喪失，隨著疾病惡性進展可造成患者因呼吸衰竭而死亡。肺泡上皮細胞惡性增殖、肺泡炎及成纖維細胞增殖等均可參與肺纖維化形成過程。已有報道指出miRNA 在肺纖維化形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此本研究尋找miRNA 并分析其在肺纖維化發(fā)生中的分子機制，為肺纖維化的防治提供新方向。

表4 干擾miR-212抑制TGFβ1誘導A549細胞EMT和COL1a1蛋白表達（n=9）/x ± s

表5 雙熒光素酶報告實驗（n=9）/x ± s

表6 miR-212靶向TOB2調(diào)控其表達（n=9）/x ± s

圖3 檢測A549細胞中CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、α-SMA和COL1a1蛋白表達

miR-212 與miR-132 結構相同并具有相似生物學功能，研究表明miR-212 在多種炎癥性疾病中呈高表達，并可能參與腫瘤、神經(jīng)等相關性疾病發(fā)生發(fā)展過程。但miR-212 在肺纖維化中的表達變化尚未可知。本研究通過TGF-β1 誘導肺泡上皮A549 細胞擬構建肺纖維化模型，結果顯示TGF-β1處理后A549 細胞中miR-212 的表達水平顯著升高，提示miR-212 表達量增加可能促進肺纖維化發(fā)生。本研究進一步研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-212表達可顯著降低TGF-β1 誘導的A549 細胞增殖率，并可抑制CyclinD1 表達，說明干擾miR-212 表達可抑制TGFβ1誘導A549 細胞增殖。研究報道指出CyclinD1 可正向調(diào)控細胞周期，促進細胞增殖。提示干擾miR-212 表達可能通過抑制CyclinD1 表達而抑制A549細胞增殖從而抑制肺纖維化發(fā)展進程。研究表明TOB2 屬于抗細胞增殖基因，腦損傷發(fā)生時TOB2 表達水平降低導致機體炎癥細胞分泌量增加從而加重腦組織損傷程度，若增加TOB2 表達量可減少炎癥細胞增殖分化從而減輕腦組織內(nèi)炎癥反應。本研究結果顯示TGF-β1處理后可顯著降低A549細胞中TOB2 的表達，說明TOB2 表達量降低可能引發(fā)肺部炎癥反應導致肺纖維化發(fā)生。本研究試圖分析miR-212與TOB2的相關性，通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-212可靶向調(diào)控TOB2的表達，進一步研究顯示下調(diào)TOB2 表達可逆轉(zhuǎn)干擾miR-212 對TGFβ1 誘導A549 細胞增殖的抑制作用，提示干擾miR-212 表達可通過上調(diào)TOB2 的表達抑制TGFβ1誘導的A549細胞增殖。

表7 下調(diào)TOB2和干擾miR-212對TGFβ1誘導A549細胞增殖、EMT和纖維化的影響（n=9）/x ± s

肺纖維化發(fā)生早期可促進前炎性介質(zhì)、趨化因子表達，TGFβ1 可通過促進EMT 轉(zhuǎn)化從而促進肺纖維化惡性進展。EMT 表現(xiàn)為上皮細胞向間質(zhì)細胞進行轉(zhuǎn)化，其中上皮細胞標志物E-cadherin 表達降低，間質(zhì)標志物Vimentin表達升高，α-SMA作為間葉標記物可用于評價EMT 轉(zhuǎn)化。COL1a1 表達量升高可作為成纖維細胞增多或纖維化的有效標志物。本研究結果顯示TGFβ1 誘導A549 細胞中Vimentin、α-SMA、COL1a1 蛋白表達量顯著增加，Ecadherin 蛋白表達量顯著降低，說明TGFβ1 可促進A549 細胞EMT 轉(zhuǎn)化進程。同時本研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-212 表 達 后 可 顯 著 降 低Vimentin、α-SMA、COL1a1 蛋白表達，而促進E-cadherin 蛋白表達，但下調(diào)TOB2 的表達可部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-212 表達對TGFβ1 誘導A549 細胞EMT 及纖維化。提示干擾miR-212 表達可通過上調(diào)TOB2 的表達從而抑制TGFβ1誘導A549細胞EMT及纖維化。

綜上所述，miR-212 在TGFβ1 干預A549 細胞中呈高表達，TOB2 表達水平降低，干擾miR-212 表達可通過促進TOB2 的表達而抑制TGFβ1 誘導的A549 細胞纖維化及EMT 轉(zhuǎn)化進程，可為肺纖維化的防治提供潛在靶點。但關于其具體作用機制仍需進一步研究。