李孝平，李偉，高芳芳，黃朝剛，何天佑，孫智珺

作者單位：武漢市第三醫(yī)院普外科，湖北 武漢430060

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命健康，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥對(duì)胃癌的防治具有良好療效。中藥多糖可通過(guò)藥理因素調(diào)節(jié)人體免疫功能，且具有抗腫瘤作用，能夠?yàn)獒t(yī)學(xué)臨床腫瘤治療提供有效幫助。研究報(bào)道獼猴桃根多糖、紅花多糖可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。山楂多糖是山楂中有效生物活性物質(zhì)，具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤以及調(diào)血脂等藥理作用。有研究發(fā)現(xiàn)山楂多糖提取物可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。而山楂多糖提取物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制尚未可知。miRNA 能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物過(guò)程，參與調(diào)控多種癌癥發(fā)生，也與胃癌進(jìn)程相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-146a-5p 在非小細(xì)胞肺癌中起抑癌作用。人參皂苷Rh2 通過(guò)上調(diào)miR-146a-5p 抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高腹膜轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細(xì)胞中miR-146a-5p 下調(diào)表達(dá)。然而miR-146a-5p 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚未清楚。本研究自2018 年3 月至2019 年3月研究山楂多糖提取物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制及與miR-146a-5p的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞AGS 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、Annexin V-FITC/PI 試劑盒購(gòu)自日本同仁研究所；蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Epigentek 公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Progema公司。

1.2 方法

1.2.1

山楂多糖提取物的制備 山楂購(gòu)自本地大型超市，將山楂洗凈后切片、烘干，按料液比1∶20的比例加入蒸餾水后打漿，90 ℃熱水浴提取6 h，加入0.1%的果膠酶45 ℃提取3 h，于80 ℃下滅酶10 min，離心收集上清液并濃縮，將濃縮液用95%的乙醇醇沉，離心收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于水中，再次醇沉，離心收集沉淀，置于烘箱中烘干至恒重，得山楂多糖提取物。

將所得提取物經(jīng)苯酚-硫酸法檢測(cè)其為多糖提取物；將該粗多糖提取物加入胰蛋白酶于65 ℃孵育2 h，離心后去除沉淀，得到脫蛋白的多糖溶液；將其轉(zhuǎn)移到層析袋中進(jìn)行反復(fù)透析48 h，然后離心、濃縮、醇沉，得到半純品；再將半純品多糖用Sephadex G-100 凝膠柱層析，得純多糖提取物。然后檢測(cè)多糖含量。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取4 mg葡萄糖溶于100 mL純水中，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 補(bǔ)水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL 和濃硫酸0.5 mL，搖勻，靜置20 min 后檢測(cè)490 nm 處吸光度值，以水為空白對(duì)照做同樣顯色處理。橫坐標(biāo)為吸光度值，縱坐標(biāo)為糖含量。取1.0 mL 的多糖溶液按上述步驟操作，測(cè)吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線作測(cè)多糖含量。用高效液相凝膠色譜法檢測(cè)多糖純度。

1.2.2

細(xì)胞培養(yǎng)與分組 胃癌細(xì)胞AGS 用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AGS 細(xì)胞，分別為200、400、800 μg/mL 的山楂多糖提取物處理，作為不同濃度山楂多糖提取物組；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照（NC）組；用800 μg/mL 的甘露醇處理作等滲對(duì)照，記為800 μg/mL 甘露醇組。將miR-146a-5p 過(guò)表達(dá)載體及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞中，作為miR-NC 組、miR-146a-5p 組；將miR-146a-5p 抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至AGS 細(xì)胞后用濃度為800 μg/mL 的山楂多糖提取物處理，作為antimiR-NC+山楂多糖提取物組、anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物組。轉(zhuǎn)染均按照Lipofectamine2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3

MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖率 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說(shuō)明操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度（OD）值。

1.2.4

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5

蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)蛋白cyclinD1、cleaved-caspase-3、β-catenin 表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，定量后取50 μg 進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.6

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-146a-5p 表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，循環(huán)條件為95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延長(zhǎng)30 s，共40 個(gè)循環(huán)；相對(duì)表達(dá)量采用2法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0 分析，計(jì)量資料用x ± s 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度山楂多糖提取物對(duì)胃癌細(xì)胞AGS 增殖的影響

對(duì)照組胃癌細(xì)胞AGS 的增殖率為（100.10±10.02）%，200、400、800 μg/mL 山楂多糖提取 物 組 分 別 為（85.12±8.51）%、（68.22±6.82）%和（42.11±4.21）%，與對(duì)照組相比，200、400、800 μg/mL山楂多糖提取物組胃癌細(xì)胞AGS 的增殖率降低（F=31.314，P ＜0.05）。

圖1 不同濃度山楂多糖提取物對(duì)胃癌細(xì)胞AGS凋亡的影響：A為細(xì)胞凋亡流式圖；B為cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)印跡圖

2.2 不同濃度山楂多糖提取物對(duì)胃癌細(xì)胞AGS 凋亡的影響

與對(duì)照組相比，800 μg/mL 甘露醇組AGS 細(xì)胞的凋亡率、cleaved-caspase-3的表達(dá)水平無(wú)顯著變化；而不同濃度山楂多糖提取物組胃癌細(xì)胞AGS 凋亡率升高，cleaved-caspase-3 表達(dá)水平升高（P ＜0.05）（圖1，表1）。

表1 不同濃度山楂多糖提取物胃癌細(xì)胞AGS凋亡的影響（n=3）/x ± s

2.3 山楂多糖提取物對(duì)miR-146a-5p 表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，山楂多糖提取物組胃癌細(xì)胞AGS 中miR-146a-5p 表達(dá)水平升高［（1.00±0.10）比（2.89±0.29），t=10.672，P ＜0.05］。

2.4 高表達(dá)miR-146a-5p 對(duì)胃癌細(xì)胞AGS 增殖和凋亡的影響

與miR-NC 組相比，miR-146a-5p 組胃癌細(xì)胞AGS 中miR-146a-5p 表達(dá)水平升高，cyclinD1表達(dá)水平降低，AGS細(xì)胞的增殖率降低，AGS細(xì)胞中cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，AGS細(xì)胞的凋亡率升高（P ＜0.05）（圖2，表2）。

圖2 高表達(dá)miR-146a-5p對(duì)cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.5 低表達(dá)miR-146a-5p 可以部分逆轉(zhuǎn)山楂多糖提取物對(duì)胃癌細(xì)胞AGS 增殖和凋亡的影響

與anti-miR-NC+山楂多糖提取物組相比，anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物組胃癌細(xì)胞AGS 中miR-146a-5p表達(dá)水平降低，cyclinD1表達(dá)水平升高，AGS細(xì)胞的增殖率升高，AGS細(xì)胞中cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低，AGS 細(xì)胞的凋亡率降低（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3，表3。

表2 高表達(dá)miR-146a-5p對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖和凋亡的影響（n=3）/x ± s

表3 低表達(dá)miR-146a-5p可以部分逆轉(zhuǎn)山楂多糖提取物胃癌細(xì)胞AGS增殖和凋亡的影響（n=3）/x ± s

2.6 Wnt/

β

-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，山楂多糖提取物組胃癌細(xì)胞AGS 中βcatenin 表達(dá)水平降低（P ＜0.05）；與anti-miR-NC+山楂多糖提取物組相比，anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物組胃癌細(xì)胞AGS 中β-catenin 表達(dá)水平升高（P ＜0.05）。見(jiàn)圖4，表4。

圖3 低表達(dá)miR-146a-5p對(duì)cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖4 β-catenin蛋白的表達(dá)

表4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)（n=3）/x ± s

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在癌前病變、術(shù)前新輔助化療、術(shù)后化療、延長(zhǎng)患者生存期等方面對(duì)治療胃癌有較好療效。山楂是一種純天然的藥食同源的植物果實(shí)，其提取物具有抗氧化和延長(zhǎng)壽命作用。山楂黃酮提取物也能夠有效地抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究顯示山楂原花青素提取物可抑制肝癌SMMC-7721 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。山楂多糖提取物可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。本研究顯示，不同濃度山楂多糖提取物處理的胃癌細(xì)胞AGS中細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高，cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高。說(shuō)明山楂多糖提取物可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究表明miRNA 也參與調(diào)控癌癥的進(jìn)展，miR-146a-5p 在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中低表達(dá)，miR-146a-5p 過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)非雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞的凋亡。miR-146a-5p 過(guò)表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和血管生成。本研究顯示，高表達(dá)miR-146a-5p 后胃癌細(xì)胞AGS 的增殖率降低，凋亡率升高，說(shuō)明高表達(dá)miR-146a-5p 可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。表明miR-146a-5p 在胃癌中起抑癌作用。還有研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮通過(guò)調(diào)控miR-146a-5p/表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）軸抑制非小細(xì)胞肺癌。本研究顯示，山楂多糖提取物處理后，miR-146a-5p 表達(dá)水平升高，而低表達(dá)miR-146a-5p 部分逆轉(zhuǎn)了山楂多糖提取物對(duì)胃癌細(xì)胞AGS 增殖和凋亡的影響。說(shuō)明山楂多糖提取物可能通過(guò)上調(diào)miR-146a-5p抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控癌癥達(dá)發(fā)生發(fā)展等過(guò)程，且與胃癌的進(jìn)展有關(guān)。研究報(bào)道沉默β-catenin 可促進(jìn)胃癌MGC-803 細(xì)胞凋亡，抑制其侵襲。漢黃芩素可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山楂多糖提取物處理的胃癌細(xì)胞AGS 中β-catenin 表達(dá)水平降低，說(shuō)明山楂多糖提取物可抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活。而低表達(dá)miR-146a-5p 逆轉(zhuǎn)了山楂多糖提取物對(duì)βcatenin 表達(dá)的抑制作用。說(shuō)明山楂多糖提取物可能通過(guò)調(diào)控miR-146a-5p 進(jìn)而調(diào)控β-catenin 的表達(dá)而影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，山楂多糖提取物可能通過(guò)上調(diào)miR-146a-5p進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活而抑制胃癌細(xì)胞AGS 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。將可為中藥多糖治療胃癌提供了新思路。