劉文杰，吳菡，黃建，周武碧

作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院病理科，江蘇 淮安223300

胃癌（GC）通常預(yù)后較差，目前是全球第四大常見癌癥，且是東亞地區(qū)最常見的癌癥。盡管已提出許多策略來(lái)提高病人存活率，但晚期GC 患者的中位存活時(shí)間仍為約12 個(gè)月。因此，需要更深入的探討胃癌的分子發(fā)病機(jī)制，以改進(jìn)胃癌治療的新方法。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）屬于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）家族成員，其在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活相關(guān)通路中具有重要作用。市面上最常見的人源化的抗HER2 單抗為曲妥珠單抗，其可通過(guò)抑制HER2 二聚體、胞內(nèi)吞HER2 及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒等途徑抑制腫瘤的惡化。大量研究報(bào)道，HER2 在胃癌患者中的表達(dá)異常升高。但是，HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞生物性行為的影響未有研究。2018年11月至2019年6月進(jìn)行本研究，擬通過(guò)檢測(cè)胃癌細(xì)胞中HER2 的表達(dá)，探討過(guò)表達(dá)HER2、敲減HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲及凋亡的影響，旨在揭示HER2在胃癌進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

永生化的正常胃上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；噻唑藍(lán)試劑（MTT）、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sellect 公司；Lipofectamine2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自大連Takara 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；放射免疫沉淀測(cè)定（RIPA）蛋白裂解液和電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coming公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823以及正常胃上皮細(xì)胞GES-1均用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（37 ℃，含5%二氧化碳）。用胰蛋白酶消化75%匯合細(xì)胞，按照1∶3的比例更換培養(yǎng)基，每周傳代3次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將正常培養(yǎng)的永生化的正常胃上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823 分別標(biāo)記為GES-1 組、SGC-7901 組、MGC-803 組、BGC-823 組；將SGC-7901 細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字表法分為pcDNA 3.1 組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC 組、si-HER2 組。處理方法為，按照脂質(zhì)體Lipofectamine2000 的試劑盒說(shuō)明書要求分別將pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-HER2、si-NC、si-HER2 轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞，先用無(wú)血清培養(yǎng)液孵育6 h，再更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，western blot 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。收集轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中HER2 mRNA 表達(dá)Trizol 法 提 取SGC-7901、MGC-803、BGC-823 以 及GES-1 細(xì)胞總RNA，微量核酸蛋白測(cè)定儀分析各樣本RNA 濃度和純度。調(diào)整RNA 樣品濃度，使用Ta-KaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，進(jìn)行qRTPCR 擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2法分析HER2（GAPDH作為內(nèi)參）的相對(duì)表達(dá)。

1.2.4 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取適量pcDNA 3.1組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC組、si-HER2組細(xì)胞加入96 孔板，在培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí)加入20 μL 的MTT工作液（5 g/L）孵育細(xì)胞4 h，棄去上清后，向各孔內(nèi)添加150 μL 二甲基亞砜，緩慢振蕩至結(jié)晶溶解，檢測(cè)細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)下吸光度（A）。細(xì)胞的增殖活力與各孔A值成正比。

1.2.5

Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲 將Transwell 小室置于添加500 μL 的RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）24 孔板上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡30 min。用純RPMI 1640 培養(yǎng)基將pcDNA 3.1 組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC 組、si-HER2組細(xì)胞均配制成5×10個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液。在上室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為1×10個(gè)）。常規(guī)培養(yǎng)24 h 取出上腔，去除上室膜上未遷移細(xì)胞，甲醇固定30 min，1 g/L 結(jié)晶紫染液染色20 min。雙蒸水洗去染色液。將Transwell 小室放在倒置顯微鏡下拍照（400 倍），計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野（上、下、左、右、中）的總細(xì)胞數(shù)取平均值記為遷移細(xì)胞數(shù)。

取60 μL 按照1∶8 比例稀釋基質(zhì)膠包被Transwell 小室上表面，置于培養(yǎng)箱當(dāng)基質(zhì)膠凝固后備用，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6

Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 用500 μL 的Binding Bμffer 懸浮pcDNA 3.1 組、pcDNA 3.1-HER2 組、si-NC 組、si-HER2 組細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-/FITC 置于暗盒內(nèi)反應(yīng)20 min，再添加5 μL的PI反應(yīng)20 min。用300目銅篩過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用早期凋亡率和晚期凋亡率之和表示細(xì)胞凋亡率。

1.2.7

Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中HER2、p16、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）、裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的蛋白表達(dá) 將pcDNA 3.1組、pcDNA 3.1-HER2組、si-NC組、si-HER2組細(xì)胞置于冰上，用RIPA法提取各組細(xì)胞蛋白樣品。定量后，向適量蛋白樣品中加入4備體積的上樣緩沖液（×5），經(jīng)100 ℃加熱10 min變性蛋白。每組均取60 μg樣品按照100 V、110 min進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置20 mA轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。隨后將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于孵育盒，室溫下加入5%脫脂奶粉孵育1 h，再在4 ℃下加入1∶500～1∶1 000稀釋的一抗孵育12 h，最后在室溫下用1∶1 500稀釋的二抗中反應(yīng)2 h。將孵育盒置于暗室內(nèi)，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，Quantity One 4.62軟件分析目的條帶相對(duì)灰度值表示目的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)量資料用x ± s表示，采用t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用單因素方差分析和Bonferroni 校正的t 檢驗(yàn)。P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中HER2 的表達(dá)

SGC-7901、MGC-803、BGC-823 細(xì) 胞 中HER2 的mRNA 表 達(dá)（t =4.163，14.896，19.580；P = 0.0002，0.000，0.000）和蛋白表達(dá)（t = 20.834，15.497，13.957；P = 0.000，0.000，0.000）均顯著高于GES-1細(xì)胞。見圖1、表1。

圖1 人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）在胃癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

表1 人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)（n=9）/x ± s

2.2 過(guò)表達(dá)HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

pcDNA 3.1-HER2 組SGC-7901 細(xì)胞中HER2 表達(dá)高于pcDNA 3.1 組，細(xì)胞增殖活力（48、72 h 時(shí)）顯著高于pcDNA 3.1組（P ＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 過(guò)表達(dá)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）的胃癌細(xì)胞中HER2蛋白表達(dá)

表2 過(guò)表達(dá)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響（n=9）/x ± s

2.3 過(guò)表達(dá)HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞遷移侵襲的影響

pcDNA 3.1-HER2 組SGC-7901 細(xì)胞中HER2 的蛋白表達(dá)顯著高于pcDNA 3.1 組，細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均高于pcDNA 3.1 組（P ＜0.05）。見圖3A、圖3C，表3。

表3 過(guò)表達(dá)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）對(duì)胃癌細(xì)胞遷移侵襲的影響（n=9）/x ± s

2.4 過(guò)表達(dá)HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

pcDNA 3.1-HER2組SGC-7901細(xì)胞中HER2表達(dá)顯著高于pcDNA 3.1組，細(xì)胞凋亡率顯著低于pcDNA 3.1組（P ＜0.05）。見圖3B、圖3D，表4。

表4 過(guò)表達(dá)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響（n=9）/x ± s

2.5 敲減HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

與si-NC 組相比，si-HER2 組SGC-7901細(xì)胞中HER2 表達(dá)顯著低于si-NC 組。si-HER2 組SGC-7901 細(xì)胞增殖活力（48、72 h 時(shí)）、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于si-NC 組，細(xì)胞凋亡率顯著高于si-NC 組。與pcDNA 3.1 組相比，pcDNA 3.1-HER2 組SGC-7901 細(xì)胞中p16、p21、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均顯著降低，MMP-9、MMP-2 蛋白表達(dá)均顯著升高，與si-NC 組相比，si-HER2組細(xì)胞中p16、p21、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均顯著升高，MMP-9、MMP-2 蛋白表達(dá)均顯著降低。見圖4和表5，6。

3 討論

HER2是位于染色體位置17q21的原癌基因，在上皮，間充質(zhì)和神經(jīng)起源的組織中編碼185 kDa 的跨膜糖蛋白。HER2 屬于受體酪氨酸激酶家族，其包含4 個(gè)成員：HER1（又稱ERBB1），HER2（又稱ERBB2），HER3（又 稱ERBB3）和HER4（又 稱ERBB4）。來(lái)自這些受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由配體與受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，然后受體二聚化和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)特定酪氨酸殘基的反式自磷酸化引發(fā)。然而，HER2 是一種孤兒受體，并且始終處于活躍的構(gòu)象。在HERs 中，HER2 是與其他HER 受體異二聚化的優(yōu)選結(jié)合伴侶，并且在過(guò)表達(dá)時(shí)也是同二聚化的。HER2 的同源和異源二聚化導(dǎo)致幾種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，包括磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）和絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑以及許多其他關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)元件，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）和c-JUN。這些信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、增殖、存活、遷移、分化、凋亡等細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。此外，據(jù)報(bào)道，HER2 的羧基末端部分（約90～100 kDA 稱為p95HER2）在其切割后易位至細(xì)胞核，并作為核因子在某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中相互作用。張婷等在胃癌的研究中早已報(bào)道，HER2 高表達(dá)與胃癌患者較低的分化程度有關(guān)。崔建新及有關(guān)研究報(bào)道，HER2 可調(diào)控曲妥珠單抗對(duì)胃癌患者的治療效果，其在胃癌的診斷及靶向治療中均具有重要意義。劉曉偉與張宏在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，HER2 的表達(dá)水平與癌組織的分化具有緊密相關(guān)性，與患者的性別、年齡、腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)程度無(wú)關(guān)。令人遺憾的是，HER2 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞表型變化的影響并未進(jìn)行深入的研究。本研究表明，胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823 中HER2 在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)均明顯升高，這與胃癌癌組織中HER2 呈高表達(dá)相一致。本研究選擇HER2 表達(dá)差異較大的SGC-7901 細(xì)胞進(jìn)行體外研究，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)HER2 顯著增加SGC-7901 細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力，并降低凋亡率，而敲減HER2 則可抑制SGC-7901 細(xì)胞的增殖、遷移侵襲并促進(jìn)凋亡，這說(shuō)明HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞的惡性表型變化具有促進(jìn)作用，這為探索HER2 在胃癌細(xì)胞中的功能機(jī)制提供充分的支持。深入研究發(fā)現(xiàn)，HER2 可調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白p16、p21，遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-9、MMP-2 和凋亡相關(guān)蛋白cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表達(dá)，提示HER2 對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制可能與調(diào)控p16、p21、MMP-9、MMP-2、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表達(dá)相關(guān)。這為HER2在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制研究提供參考。

表5 敲減人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移侵襲及凋亡的影響（n=9）/x ± s

表6 人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）表達(dá)改變對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移侵襲及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響（n=9）/x ± s

綜上所述，HER2 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控p16、p21、MMP-9、MMP-2、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表達(dá)相關(guān)，為HER2 生物制劑在胃癌治療中的應(yīng)用提供支持。

（本文圖3，4見插圖2-2）