付偉超，安崇佑，任彥松，孫 靜，文亞男，張 森，于文穎，梁昊岳*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300020；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津300052）

0 引言

近年來，流式細(xì)胞儀獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。目前，流式細(xì)胞儀的發(fā)展趨勢是多激光多色、小型化和高速分析分選等。此外，流式細(xì)胞儀聚焦原理多樣化以及與其他生物學(xué)技術(shù)密切結(jié)合也是流式細(xì)胞儀發(fā)展的一大特色，既可以幫助研究者分析細(xì)胞的大小和顆粒度等物理參數(shù)，又可以幫助研究者分析細(xì)胞周期及其增殖、凋亡和表型變化等化學(xué)性質(zhì)[1]。因此，流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛[2-5]。如以BD Influx和BD cantoⅡ為代表的應(yīng)用流體力學(xué)原理設(shè)計的傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀和其他基于新技術(shù)設(shè)計的新型流式細(xì)胞儀在科學(xué)研究領(lǐng)域都發(fā)揮著重要作用。雖然在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上發(fā)展出了基于聲波聚焦原理的Attune?流式細(xì)胞儀、基于微毛細(xì)管技術(shù)的Guava easyCyte系列流式細(xì)胞儀、將流式細(xì)胞檢測與顯微成像相結(jié)合的FlowSight顯微成像流式細(xì)胞儀、基于粗波分復(fù)用技術(shù)的Cytek Aurora全光譜流式細(xì)胞儀和采用金屬元素標(biāo)記物識別信號分子的CyTOF2質(zhì)譜流式細(xì)胞儀等[6-8]，但是BD Influx和BD CantoⅡ流式細(xì)胞儀始終作為流式細(xì)胞分選和分析的高端機(jī)型被應(yīng)用于科學(xué)研究。

完善的技術(shù)培訓(xùn)體系是大型儀器規(guī)范管理、維護(hù)儀器良好運(yùn)行狀態(tài)的基礎(chǔ)，而良好的儀器狀態(tài)又是支撐技術(shù)培訓(xùn)工作、開展科研實(shí)驗的重要保障。二者息息相關(guān)，密切配合，共同為科研院所流式中心的正常運(yùn)轉(zhuǎn)奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。且以技術(shù)培訓(xùn)和儀器維護(hù)為依托的流式中心平臺正充分發(fā)揮著國家重點(diǎn)實(shí)驗室科研技術(shù)平臺的科研支撐、窗口展示和輻射周邊院所的功能，為流式技術(shù)的提升、成果轉(zhuǎn)化和人才培養(yǎng)貢獻(xiàn)應(yīng)有的力量。

本文結(jié)合科研平臺流式細(xì)胞儀的運(yùn)轉(zhuǎn)情況，以BD CantoⅡ為例介紹檢測正常人外周血na?ve細(xì)胞和靜息態(tài)T細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法以及儀器校準(zhǔn)、電壓調(diào)節(jié)、熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)等實(shí)驗?zāi)０宓慕⒘鞒?，并以BD Influx為例分析流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)，重點(diǎn)介紹多色流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)培訓(xùn)中實(shí)驗?zāi)０褰?、電壓調(diào)節(jié)、補(bǔ)償調(diào)節(jié)等相關(guān)內(nèi)容，并對2010—2018年實(shí)驗血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室科研技術(shù)平臺流式中心BD Influx流式細(xì)胞儀的使用記錄進(jìn)行統(tǒng)計分析，列舉常見故障，并詳細(xì)闡明引起故障的原因及處理方法，探討流式細(xì)胞儀日常維護(hù)和專項技術(shù)培訓(xùn)一體化管理模式，旨在為相關(guān)儀器管理者和使用者提供借鑒。

1 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)

流式細(xì)胞儀在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、光學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用空間。本文以BD Influx流式細(xì)胞儀為例，介紹流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)。BD Influx流式細(xì)胞儀可選擇搭載1～5根激光器，支持FITC、PE、PE-Cy7、PercP、APC、APC-Cy7、Hoechst Blue、Hoechst Red等一系列熒光通道檢測的需要；采用可完全更換的液路裝置，充分保證了細(xì)胞活性，避免了菌類污染的發(fā)生。BD Influx是空氣激發(fā)的流式細(xì)胞儀，其光路系統(tǒng)將激光直接照射到液流上，使光路調(diào)節(jié)十分方便、直觀。且BD Influx流式細(xì)胞儀的光路之間互相獨(dú)立，可獨(dú)立完成調(diào)節(jié)和聚焦，以便從不同角度與液流相交形成空間立體。這種設(shè)計較好地避免了光信號經(jīng)過石英杯流動室時所受到的干擾，為更好地提高流式細(xì)胞群比例和熒光強(qiáng)度檢測的效率和穩(wěn)定性奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。

在上述儀器設(shè)計的基礎(chǔ)上，BD Influx流式細(xì)胞儀的功能應(yīng)用也較為廣闊。BD Influx流式細(xì)胞儀不僅可用于完成細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞死活鑒定、熒光蛋白檢測、細(xì)胞表型、核酸含量檢測、線粒體活性、胞內(nèi)鈣離子、pH值、細(xì)胞增殖、藥物攝取評價、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡、罕見細(xì)胞群檢測、小顆粒檢測等各種高通量流式細(xì)胞分析和分選實(shí)驗，還可用于自發(fā)熒光種群的分析鑒定、未知熒光物質(zhì)研究、環(huán)境和海洋生物學(xué)研究以及衡量熒光蛋白、熒光能量轉(zhuǎn)移等方面。BD Influx流式細(xì)胞儀能夠檢測低至200 nm的顆粒，這種高分辨力的小顆粒檢測功能對海洋生物學(xué)、微生物學(xué)和環(huán)境生物學(xué)的研究具有特殊的應(yīng)用價值。

與此同時，在日常開展上述部分實(shí)驗研究時發(fā)現(xiàn)，BD Influx流式細(xì)胞儀可以進(jìn)行多熒光、多參數(shù)定量分析及無菌高速分選，具有消耗鞘液量少、分選速度快、分選后細(xì)胞活性高等特點(diǎn)。但對操作者技術(shù)要求較高，使用過程較為復(fù)雜，需要經(jīng)過完整的培訓(xùn)和長時間的實(shí)踐才能很好地掌握操作技術(shù)，完成細(xì)胞分析和分選。

2 流式細(xì)胞儀技術(shù)培訓(xùn)

2.1 材料和方法

2.1.1 儀器與材料

BD CantoⅡ三激光（405、488、633 nm）流式細(xì)胞儀，購自美國碧迪公司；CST質(zhì)控微球，購自美國碧迪公司；PE標(biāo)記的抗人CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD45RO抗體、PerCP-Cy5.5標(biāo)記的抗人CD45RA抗體、PE-Cy7標(biāo)記的抗人CD4抗體、APC標(biāo)記的抗人CD25抗體、APC-Cy7標(biāo)記的抗人CD8抗體、BV510標(biāo)記的抗人CD127抗體等帶有熒光素的單克隆抗體，購自美國碧迪公司；DAPI染料，購自美國Sigma公司；紅細(xì)胞裂解液（ACK），購自北京索萊寶科技有限公司。

2.1.2 方法

2.1.2.1 儀器質(zhì)控

取0.5 mL去離子水至5 mL流式管中，滴入2滴CST質(zhì)控微球，制成質(zhì)控試劑溶液。進(jìn)入Diva軟件在Cytometer下進(jìn)入CST質(zhì)控系統(tǒng)，將與所購CST質(zhì)控微球批次相同的批次文件導(dǎo)入CST質(zhì)控系統(tǒng)后，執(zhí)行Baseline。BD CST質(zhì)控微球可提供特定的信息，通過Diva軟件的解讀可從這些信息中得出線性、背景噪聲、電子噪聲和檢測效率等方面的信息。且這些微球能夠評估流式細(xì)胞儀的運(yùn)行狀態(tài)，以便根據(jù)收集到的不同參數(shù)確定最佳激光延遲設(shè)置。

2.1.2.2 多色流式樣本制備

多色演示實(shí)驗共分為3組，分別設(shè)置陰性管、單陽對照管和實(shí)驗樣本管。其中，設(shè)置陰性管1個，只加入細(xì)胞，不加任何單克隆抗體或DAPI染色液，用于演示鑒定陰性和陽性細(xì)胞群體；單陽對照管8個，每管只加入1種單克隆抗體或DAPI染色液，用于演示調(diào)節(jié)各熒光素之間的熒光溢漏；實(shí)驗樣本管1個，加入全部單克隆抗體和DAPI染色液，用于演示對各類T細(xì)胞分型。取健康人新鮮外周血，裂解紅細(xì)胞后，將所得細(xì)胞平均分成10份，分別加入到對應(yīng)的陰性管、單陽對照管和實(shí)驗樣本管。陰性管可不做處理備用，單陽對照管和實(shí)驗樣本管分別使用對應(yīng)的流式抗體染色，避光孵育30 min后用3 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞，離心并去除上清液后用適量PBS重懸細(xì)胞，避光備用。

2.1.2.3 多色流式培訓(xùn)演示

多色流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗?zāi)０宓慕⑿枰ＷC各熒光通道電壓合適以及各熒光素通道之間的熒光補(bǔ)償準(zhǔn)確。在演示多色流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗?zāi)０褰⒘鞒虝r，首先使用實(shí)驗樣本管調(diào)節(jié)各通道電壓，將陰性群和陽性群調(diào)至合適位置。電壓設(shè)定的原則為對低表達(dá)的群體有著良好的分辨力，陽性群熒光信號不能超出線性范圍。一般控制陰性群在103以內(nèi)，陽性群位于103～104，可根據(jù)實(shí)際情況微調(diào)，有相互補(bǔ)償?shù)膬蔁晒馔ǖ离妷簲?shù)值盡量不要相差過大。確定電壓后不再更改，依次上樣各熒光抗體單陽對照管，記錄數(shù)據(jù)后調(diào)節(jié)補(bǔ)償大小。補(bǔ)償調(diào)節(jié)遵循橫平豎直的原則，各單陽對照管調(diào)節(jié)補(bǔ)償方法一致，演示以PE單陽對照管為例，PE單陽對照管中陰性群和陽性群在其他熒光通道的熒光值中位數(shù)應(yīng)當(dāng)一致。補(bǔ)償調(diào)節(jié)時，單陽對照管調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)霓k法為畫出雙指數(shù)顯示方式的散點(diǎn)圖，固定橫坐標(biāo)為單陽對照管所帶熒光，依次切換縱坐標(biāo)，將陰性群和陽性群的細(xì)胞熒光中位數(shù)調(diào)成一致，以此辦法調(diào)節(jié)每個單陽對照管補(bǔ)償。上樣陰性管，記錄數(shù)據(jù)，與陰性管熒光信號一致的群體為陰性群，高于陰性管熒光信號的群體為陽性群。最后，上樣實(shí)驗樣本管，記錄數(shù)據(jù)，得到標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗結(jié)果，即多色流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗?zāi)０褰⑼瓿?。在流式?xì)胞儀穩(wěn)定狀態(tài)下，本演示實(shí)驗中建立的電壓、補(bǔ)償參數(shù)數(shù)值可用于后期實(shí)驗的參考。

2.2 結(jié)果

2.2.1 儀器質(zhì)控報告

CST質(zhì)控系統(tǒng)運(yùn)行過程中可實(shí)時顯示藍(lán)激光器、紅激光器和紫激光器下微球的信號狀態(tài)，如圖1所示。質(zhì)控結(jié)果顯示，流式細(xì)胞儀狀態(tài)良好，可以進(jìn)行流式分析實(shí)驗。

2.2.2 熒光通道補(bǔ)償調(diào)節(jié)結(jié)果（以CD3-PE單陽對照管為例）

圖1 CST質(zhì)控實(shí)時圖

全陽管上樣后各通道信號參差不齊，部分壓線，部分聚集在左邊，陰性群和陽性群區(qū)分不明顯。通過調(diào)整各通道的電壓值，使得細(xì)胞群在流式圖中處于合適的位置。多色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示所有收集到的熒光信號，包括細(xì)胞信號和碎片信號。與細(xì)胞碎片不同，完整的細(xì)胞形態(tài)較大，前側(cè)向熒光信號較強(qiáng)，如圖2（a）所示，圖中紅色部分為細(xì)胞群體。圖2（b）中顯示了圈選細(xì)胞群后的CD3-PE通道，調(diào)整光電倍增管電壓使陰性群處于103個以內(nèi)，陽性群處于103～104個，細(xì)胞群整體分布合適。

以CD3-PE單陽對照管為例，調(diào)節(jié)PE和PerCPcy5.5之間的熒光補(bǔ)償。補(bǔ)償未調(diào)節(jié)時，PE單陽細(xì)胞群的熒光信號會溢漏至PerCP-Cy5.5通道，PE單陽群在PerCP-cy5.5通道出現(xiàn)假陽性信號，該群體會被誤認(rèn)為是PE和PerCP-cy5.5的雙陽性細(xì)胞群，從而影響細(xì)胞群的比例判定，如圖2（c）所示。補(bǔ)償調(diào)節(jié)后，陰性細(xì)胞群和單陽細(xì)胞群2個群體在水平方向上密度中心處于平行狀態(tài)，陽性細(xì)胞群不再向右上傾斜，PerCP-Cy5.5不再出現(xiàn)假陽性信號，表示熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)適當(dāng)，如圖2（d）所示。

圖2 多參數(shù)流式模板調(diào)節(jié)示意圖

2.2.3 人外周血T細(xì)胞流式分析結(jié)果

電壓和熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)完成后，上樣實(shí)驗樣本管，不做任何改動，直接記錄數(shù)據(jù)，逐級圈門，得到目標(biāo)細(xì)胞群比例。健康人外周血T細(xì)胞根據(jù)表面抗原的不同，可分為不同功能的T細(xì)胞。本研究中利用CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RO、CD45RA共7個經(jīng)典抗原和DAPI染料對健康人外周血T細(xì)胞中的effective Treg?ve Treg進(jìn)行鑒定。

首先通過DAPI染料在CD3、CD4、CD8、CD25和CD127中鑒別出人外周血Treg細(xì)胞（如圖3所示），其表型為DAPI-CD3+CD4+CD8-CD25+CD127low，結(jié)果中Treg流式圖形較為典型。Treg細(xì)胞可根據(jù)CD45RO和CD45RA兩種標(biāo)記物進(jìn)一步分為na?ve Treg和effective Treg，如圖3（f）所示。其中，na?ve Treg表型為CD45RO-CD45RA+，effective Treg表型為CD45RO+CD45RA-，2種細(xì)胞分別占Treg細(xì)胞的比例分別為16.4%和68.8%，如圖3（g）所示。圖4展示了人外周血樣本流式分析中各通道熒光的表達(dá)情況，陰性群、陽性群的分布與經(jīng)典的逐級圈門方式結(jié)果相符。

3 流式細(xì)胞儀的維護(hù)管理

3.1 技術(shù)培訓(xùn)過程中的常見故障案例

3.1.1 案例一

3.1.1.1 故障現(xiàn)象

液流啟動異常。

3.1.1.2 故障分析與維修

此故障發(fā)生的原因可能有：（1）鞘液不足或鞘液桶未擰緊；（2）廢液桶未擰緊；（3）噴嘴堵塞；（4）鞘液未充滿液路。

全面觀察BD Influx流式細(xì)胞儀（如圖5所示），本著先易后難的原則逐個排查故障。（1）檢查鞘液桶內(nèi)鞘液是否不足，如不足則更換一桶新的鞘液并擰緊鞘液桶蓋。（2）查看廢液桶中廢液是否過多，若廢液過多則清空廢液桶并擰緊廢液桶蓋。（3）取下噴嘴，使用超聲儀將噴嘴超聲清洗1～2 min后，使用無菌注射器沿液流相反方向沖洗噴嘴，然后再沿液流相同方向沖洗噴嘴，如果注射器打出的液流呈直線狀，則噴嘴清洗完成。最后將噴嘴安裝到細(xì)胞儀上并擰緊，確保O型圈密封良好。（4）在噴嘴孔下面放置沖洗槽，按Rinse鍵打開液流，30 s后關(guān)閉液流，反復(fù)開關(guān)幾次，使鞘液充滿液路。

對故障原因逐一進(jìn)行排查后，液流正常啟動。BD Influx流式細(xì)胞儀推薦使用型號為100μm的噴嘴，液流啟動后鞘液壓力為0.118 MPa、樣本壓力為0.125 MPa為宜，這樣有利于保證液流的穩(wěn)定性。

3.1.2 案例二

3.1.2.1 故障現(xiàn)象

Pinhole顯示屏顯示異常。

圖3 人外周血T細(xì)胞流式分析圖

圖4 外周血T細(xì)胞流式分析小提琴圖

3.1.2.2 故障分析與維修

圖5 BD Influx流式細(xì)胞儀

此故障發(fā)生的原因可能有：（1）機(jī)器與計算機(jī)未成功連接；（2）噴嘴堵塞；（3）管路中存在氣泡；（4）Pinhole未校準(zhǔn)到最佳位置。

排除方法：（1）依次重新開啟主電源、真空泵、空氣壓縮機(jī)、流式細(xì)胞儀的電子系統(tǒng)、計算機(jī)、激光開關(guān)、加壓閥和FACS軟件。（2）按要求超聲清洗噴嘴。（3）執(zhí)行反沖和排氣泡操作，將排氣泡貯水匙放置在沖洗槽上面，匙中裝滿無菌去離子水，使噴嘴的底部尖端沒入液面以下。按“Purge”鍵使氣泡隨液流流走，當(dāng)貯水匙中充滿水后反復(fù)按“Purge”鍵數(shù)次。打開液流后，移開進(jìn)樣針位置處流式管，按“Backflush”鍵反沖30 s。（4）調(diào)節(jié)噴嘴上方的3個互相垂直的銀色旋鈕，經(jīng)Pinhole顯示屏觀察，調(diào)節(jié)X軸旋鈕使液流聚焦清楚，調(diào)節(jié)Y軸旋鈕使液流移至Pinhole中央，Z軸不調(diào)。按可能原因逐一排查故障后，Pinhole顯示屏顯示正常。

3.1.3 案例三

3.1.3.1 故障現(xiàn)象

Stream顯示屏顯示異常。

3.1.3.2 故障分析與維修

此故障發(fā)生的原因可能有：（1）噴嘴堵塞；（2）液路內(nèi)有氣泡；（3）噴嘴未調(diào)到最佳位置。

排除方法：（1）按要求超聲清洗噴嘴。為保證噴嘴不堵塞，分選的樣本應(yīng)在上樣之前用300目濾網(wǎng)過濾，再進(jìn)行分選實(shí)驗。如需分選巨核細(xì)胞等較大細(xì)胞，應(yīng)使用較大孔徑的噴嘴（如100μm孔徑噴嘴）以避免堵塞。使用BD Influx細(xì)胞儀進(jìn)行分選時，樣本濃度不宜超過107個/mL，上樣速率不宜超過30 000 events/s。（2）執(zhí)行反沖和排氣泡操作。（3）調(diào)節(jié)噴嘴上方的2個互相垂直的黑色旋鈕，經(jīng)Stream顯示屏觀察，調(diào)節(jié)前后旋鈕使噴嘴前后擺動，調(diào)節(jié)左右旋鈕使噴嘴左右擺動。反復(fù)調(diào)節(jié)上述2套旋鈕使噴嘴處于最優(yōu)位置。對故障進(jìn)行逐一排查，最終Stream顯示屏顯示正常，液流清洗穩(wěn)定。

3.1.4 案例四

3.1.4.1 故障現(xiàn)象

分選后未得到目標(biāo)細(xì)胞。

3.1.4.2 故障分析與維修

此故障發(fā)生的原因可能有：（1）振幅設(shè)置不當(dāng)。振幅設(shè)置不當(dāng)會導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞未進(jìn)入收集管中，造成目標(biāo)細(xì)胞損失。（2）Drop delay設(shè)置不當(dāng)。Drop delay設(shè)置不當(dāng)會造成目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)入廢液收集管，導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞損失。（3）偏轉(zhuǎn)板上有液滴。偏轉(zhuǎn)板上有液滴會造成振幅設(shè)置不當(dāng)，分選后不能獲得足夠的目標(biāo)細(xì)胞。（4）收集管或96孔板位置設(shè)置不當(dāng)。

排除方法：（1）振幅優(yōu)化。合上電偏轉(zhuǎn)板，在Sort Layout窗口中Sort Mode選擇“1.0 Drop Pure”，在Sorting Settings窗口中點(diǎn)擊“Test Streams”，則可在Stream顯示屏中見到測試液流分叉。若液流打在偏轉(zhuǎn)板上或不能被廢液收集器接收，可調(diào)節(jié)Maximum Drop Charge值，使液流分叉適當(dāng)。若在Test Streams條件下測試液流分叉正常，可再調(diào)節(jié)Flash Charge，同上過程優(yōu)化振幅。（2）重調(diào)Drop delay[9]。Drop delay數(shù)值的設(shè)定既影響細(xì)胞分選的得率，也影響分選的純度。Drop delay數(shù)值如偏差較大，亮斑不明顯，可加大Drop delay溶液濃度或加快上樣速度，以便觀察亮斑從右向左的變化過程。Drop delay調(diào)節(jié)完成后應(yīng)盡快進(jìn)行分選，如液流斷點(diǎn)發(fā)生變化，應(yīng)重新調(diào)節(jié)Drop delay。（3）用干燥、無菌棉簽擦拭偏轉(zhuǎn)板及附近區(qū)域，擦干后重新優(yōu)化振幅。分選過程中如發(fā)現(xiàn)Stream顯示屏中顯示偏轉(zhuǎn)板上有液滴出現(xiàn)，應(yīng)及時結(jié)束分選，擦拭偏轉(zhuǎn)板，重新優(yōu)化振幅并重調(diào)Drop delay后再繼續(xù)分選。（4）重啟Sortware軟件，依據(jù)收集管和96孔板位置調(diào)整偏轉(zhuǎn)電壓，使偏轉(zhuǎn)液流打在收集管正中或96孔板每孔正中。BD Influx流式細(xì)胞儀Sortware軟件界面如圖6所示。對故障進(jìn)行逐一排查后，顯微鏡下可看到目標(biāo)細(xì)胞。

圖6 BD Influx流式細(xì)胞儀Sortware軟件界面示意圖

3.1.5 案例五

3.1.5.1 故障現(xiàn)象

分選后細(xì)胞純度不高。

3.1.5.2 故障分析與維修此故障發(fā)生的原因可能有：（1）Drop delay調(diào)節(jié)不當(dāng)。Drop delay調(diào)節(jié)不當(dāng)，導(dǎo)致機(jī)器對液滴加電不準(zhǔn)確，目標(biāo)細(xì)胞未完全進(jìn)入收集管，同時部分非目標(biāo)細(xì)胞被錯誤加電荷，使進(jìn)入收集管分選后細(xì)胞純度不高。（2）流式分選儀管路不潔凈。流式分選儀管路不潔凈造成目標(biāo)細(xì)胞在通過管路時被污染或死亡，導(dǎo)致分選后所得細(xì)胞純度不高。

排除方法：（1）準(zhǔn)確調(diào)節(jié)設(shè)置Drop delay，具體過程見3.1.4.2。（2）完成BD Influx流式細(xì)胞儀無菌管路制備和流式分選儀月維護(hù)工作。使用無菌管路替換現(xiàn)有管路，并將鞘液桶裝滿75%酒精，沖洗管路，再用次氯酸鈉溶液沖洗管路，最后用無菌水沖洗。經(jīng)液路沖洗和準(zhǔn)確調(diào)節(jié)Drop delay，分選后細(xì)胞純度達(dá)98%以上。

3.2 需要廠家工程師現(xiàn)場解決的故障

本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，2010—2018年BD Influx流式細(xì)胞儀共計維修22次。常見故障包括硬件損壞、參數(shù)調(diào)節(jié)、軟件損壞、光路偏離、常規(guī)保養(yǎng)和其他故障等。22次維修的故障按故障發(fā)生分類和頻次降序排列，如圖7所示。

圖7 BD Influx流式細(xì)胞儀故障分類圖

3.2.1 硬件損壞

硬件損壞是BD Influx流式細(xì)胞儀在科研應(yīng)用中出現(xiàn)頻次最高的故障。硬件損壞主要包括壓力傳感器損壞、accudrop攝像頭損壞、定時器電池?fù)p壞、放氣閥損壞、壓力表損壞、全套管路損壞、過濾器損壞、上樣針損壞、噴嘴（70、100、140μm）損壞和密封圈損壞等。硬件損壞的原因包括操作不當(dāng)、配件老化和短時間集中使用造成損耗等。

儀器操作者應(yīng)充分了解BD Influx流式細(xì)胞儀的使用原理及其與常規(guī)石英杯流動室激發(fā)的流式細(xì)胞儀的區(qū)別，正確調(diào)節(jié)光路、液路（包括振幅、頻率、液滴延遲等參數(shù)），規(guī)范操作流式細(xì)胞儀的參數(shù)調(diào)試和最佳使用條件的設(shè)定[10]。同時，應(yīng)定期檢查流式細(xì)胞儀的激光器、壓力傳感器、光纖、攝像頭等重要配件工作狀態(tài)，并將有效信息及時反饋給廠家工程師，以保證儀器良好的運(yùn)行狀態(tài)，降低儀器的故障發(fā)生率和維護(hù)維修成本。廠家工程師應(yīng)定期、系統(tǒng)檢查設(shè)備，進(jìn)行專業(yè)化儀器維護(hù)保養(yǎng)和管路更換等操作。

3.2.2其他故障

BD Influx流式細(xì)胞儀其他出現(xiàn)頻次較高的故障包括液流攝像頭保護(hù)罩脫落、鞘液桶放氣閥漏氣、上樣針堵塞、液流不穩(wěn)、計算機(jī)無法啟動和光路調(diào)節(jié)旋鈕松動等。

排除方法：采取重黏液流攝像頭保護(hù)罩、擰緊鞘液桶閥、疏通上樣針、疏通或更換管路、重新插拔計算機(jī)內(nèi)存條和固定光路調(diào)節(jié)旋鈕等方法，在判斷故障原因的基礎(chǔ)上對因施策從而排除故障。

3.2.3 參數(shù)調(diào)試

在硬件未出現(xiàn)故障的情況下，因BD Influx流式細(xì)胞儀操作內(nèi)容復(fù)雜而靈活，常會出現(xiàn)分叉不穩(wěn)等情況，需要進(jìn)行儀器及軟件相關(guān)參數(shù)的調(diào)試。

排除方法：調(diào)節(jié)鞘液壓力、振幅、頻率、Drop delay等重要參數(shù)，保持儀器各方面狀態(tài)的平衡。必要時，邀請廠家技術(shù)工程師現(xiàn)場調(diào)試，加強(qiáng)流式細(xì)胞儀的操作培訓(xùn)和技術(shù)交流，提升使用者的參數(shù)調(diào)試水平，從而保證BD Influx流式細(xì)胞儀能正常運(yùn)行。

3.2.4 軟件損壞

BD Influx流式細(xì)胞儀Sortware軟件損壞會導(dǎo)致不能正常使用。軟件損壞的原因主要是軟件版本較低，需要及時更新。軟件損壞的現(xiàn)象包括流式模板損壞、流式圖顯示異常、Acquire鍵不能點(diǎn)擊等。排除方法：請工程師及時升級軟件到最新版本。同時，應(yīng)注意在使用BD Influx流式細(xì)胞儀時不得使用U盤拷貝數(shù)據(jù)，應(yīng)將數(shù)據(jù)共享到另一臺計算機(jī)上再進(jìn)行數(shù)據(jù)拷貝，以保證軟件不受病毒侵害。當(dāng)操作者發(fā)現(xiàn)軟件使用故障時，應(yīng)及時保存已產(chǎn)生的實(shí)驗數(shù)據(jù)，并通知流式技術(shù)平臺管理員進(jìn)行處理。管理員可嘗試重裝Sortware軟件并按操作流程運(yùn)行[11]，如仍無法正常使用，應(yīng)及時請廠家工程師現(xiàn)場處理。

4 結(jié)語

流式細(xì)胞儀因其檢測準(zhǔn)確率高、靈敏度強(qiáng)、適合高通量細(xì)胞生物學(xué)檢測，并與分子影像學(xué)等其他生物學(xué)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，已成為細(xì)胞生物學(xué)研究的重要手段[12-15]。完整的集理論、培訓(xùn)、上機(jī)實(shí)踐和軟件操作于一體的流式細(xì)胞儀技術(shù)培訓(xùn)和良好的儀器維護(hù)水平為科研工作的順利開展奠定了基礎(chǔ)。針對不同對象的分層級培訓(xùn)方式將在流式細(xì)胞儀使用技術(shù)培訓(xùn)中發(fā)揮更大的作用。以流式細(xì)胞儀三級培訓(xùn)為例，為初學(xué)者設(shè)計的一級培訓(xùn)側(cè)重告知儀器使用過程中的禁忌，為初學(xué)者操作儀器做好警示規(guī)范工作；為有經(jīng)驗的研究人員設(shè)計的二級培訓(xùn)側(cè)重高級分析技術(shù)的傳授和分享；為儀器維護(hù)工作人員設(shè)計的三級培訓(xùn)側(cè)重介紹儀器維護(hù)保養(yǎng)方面的知識和技巧。只有科學(xué)使用流式細(xì)胞儀并對其進(jìn)行定期保養(yǎng)，才能為流式細(xì)胞技術(shù)規(guī)范化培訓(xùn)和科學(xué)管理提供保障，保證技術(shù)平臺科學(xué)研究和研究生教育培養(yǎng)工作的順利進(jìn)行，減少儀器的故障率，降低維護(hù)成本，從而不斷推進(jìn)大型儀器技術(shù)進(jìn)步。

隨著流式技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細(xì)胞儀的配置越來越高，多色流式已成為檢測細(xì)胞群或單細(xì)胞特征的趨勢型技術(shù)。隨著科研技術(shù)平臺的發(fā)展，流式細(xì)胞儀數(shù)量越來越多，科研人員對儀器狀態(tài)的要求越來越高。做好多色流式培訓(xùn)技術(shù)，將大大提升科研人員對流式技術(shù)的理解和實(shí)踐能力，提升流式技術(shù)實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性?？蒲腥藛T能夠獨(dú)立操作，對緩解流式中心儀器多、人員不足帶來的問題有著顯著的作用。因此，加強(qiáng)儀器維護(hù)，開展多色流式技術(shù)培訓(xùn)，將對提升整個流式中心技術(shù)服務(wù)水平產(chǎn)生較為積極的影響。