文/蘇妙儀 嚴(yán)家俊 張 娟

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院）

維生素是人體神經(jīng)系統(tǒng)最重要的營養(yǎng)素，包括維生素A、B、D、E等，其中B族維生素又是重要的神經(jīng)營養(yǎng)類維生素。如果長期缺乏某種維生素，就會(huì)引起生理機(jī)能障礙而發(fā)生某種疾病。維生素?cái)z入可能降低肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，特別是維生素E和葉酸的效果更顯著[1]。葉酸屬于水溶性B族維生素，通常儲(chǔ)存于綠葉蔬菜、水果及動(dòng)物肝臟中，在蛋白質(zhì)代謝、維持人體機(jī)能等方面發(fā)揮著不可或缺的作用[2]。歐盟建議成年人每日葉酸推薦攝入量為400 μg，孕期和哺乳期婦女每日葉酸推薦攝入量為400～600 μg。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)嬰幼兒配方乳粉中強(qiáng)化維生素的含量有嚴(yán)格要求，對(duì)于嬰兒葉酸含量一般要求在2.5～12.0 μg/100 kJ之間，較大嬰兒和幼兒最低含量為1 μg/100 kJ[3，4]。葉酸能夠促進(jìn)嬰兒身體器官的發(fā)育，增加?jì)雰旱拿庖吡Φ?。因此，育齡期女性合理補(bǔ)充葉酸，是促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育的重要措施[5]。研究表明，葉酸攝入量不足或代謝通路受阻會(huì)增加腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]，葉酸水平低可能是阿爾茲海默病發(fā)生的危險(xiǎn)因素[7]，維持較好的葉酸水平對(duì)降低高血壓、預(yù)防和控制心腦血管疾病具有重要意義[8]。因此食品中葉酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定十分關(guān)鍵，對(duì)指導(dǎo)人們?nèi)粘ｏ嬍?、預(yù)防疾病具有重要意義。

目前，葉酸的檢測(cè)方法主要包括色譜法[9～13]、熒光法[14～17]、微生物法[18～19]、電化學(xué)法[20]和酶聯(lián)免疫法[21，22]等。在眾多檢測(cè)方法中，微生物法由于靈敏度高、不需要復(fù)雜設(shè)備儀器及成本低等優(yōu)點(diǎn)[25]，在最新的第十七版官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC（Association of Official Analytical Chemists）和美國谷物化學(xué)家協(xié)會(huì)分析方法中，被列為食品葉酸的第一分析方法，其定量分析原理為微生物生長需要生長因子，而葉酸是鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus caseisub sp. Rhamnosus ATCC7469）生長所必需的因子，并具有專一性。在一定條件下，鼠李糖乳酸桿菌的生長繁殖速度與溶液中葉酸的含量成正比關(guān)系，從而定量計(jì)算出葉酸的含量。但是微生物法也存在試驗(yàn)周期長，步驟繁瑣，對(duì)試驗(yàn)人員和試驗(yàn)室的要求較高，結(jié)果重復(fù)性差等局限性。因此本文在GB 5009.211-2014基礎(chǔ)上，對(duì)菌株冷凍制備保存，菌懸液濃度以及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行摸索，以縮短接種液制備時(shí)間，從而縮短整個(gè)試驗(yàn)周期，以應(yīng)對(duì)日益增長的檢測(cè)需求，對(duì)促進(jìn)嬰幼兒乳粉中葉酸含量的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品：5 組嬰幼兒配方乳粉，隨機(jī)購于各大超市；SRM 1849a質(zhì)控樣品購于美國NIST。

試驗(yàn)菌株：鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus caseispp.rhamnosus）ATCC7469，購于環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器試劑

儀器：AC2-6S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；UV-1900紫外可見分光光度計(jì)，島津（中國）有限公司。

試劑：葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基，乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制參照GB 5009.211-2014。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 接種液優(yōu)化

將鼠李糖乳酸桿菌凍干粉接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基上，（37±1）℃培養(yǎng)20～24 h。再轉(zhuǎn)種2 ～3 代增強(qiáng)活力。將活化后的菌液以8000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，混勻。重復(fù)洗脫3次，確保無殘留培養(yǎng)基。預(yù)先用50 mL含有25%甘油的葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基混勻制成菌懸液并分裝1.0mL至菌株保存管，-70 ℃凍存?zhèn)溆?。每次試?yàn)前從-70℃冰箱中取出適量的菌株儲(chǔ)備液，充分混勻。

1.3.2 適宜菌懸液濃度與培養(yǎng)時(shí)間的探索試驗(yàn)

使用0.85%生理鹽水對(duì)同一批次制成的菌株儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，調(diào)節(jié)透光率成4 種濃度測(cè)試菌液：30%、50%、70%、90%，分別加入50 μL到葉酸含量為0.00 ng和1.00 ng的試管中，一式三份。培養(yǎng)16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h和60 h，同時(shí)以葉酸含量為0.00ng作為空白對(duì)照管，540 nm下分別測(cè)定其余試管的吸光度，比較各濃度測(cè)試菌懸液的生長規(guī)律。

1.3.3 試樣制備方法的優(yōu)化[23]

試樣的制備方法參考G B 5009.211-2014并進(jìn)行優(yōu)化，取試樣約1.0 g至50 mL離心管中，加入約30 mL純水，搖勻，定容至40 mL。95 ℃水浴30 min，其間振蕩至少5 次，迅速冷卻至室溫，使用0.22 μm 濾膜過濾除菌后，稀釋相應(yīng)倍數(shù)，使葉酸稀釋液濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，備用。

1.3.4 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

以SRM 1849a質(zhì)控樣品中葉酸含量為基準(zhǔn)，按1.3.3試樣制備的優(yōu)化方法處理試樣，并采用1.3.2試驗(yàn)所得的最適菌懸液濃度和培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系，進(jìn)行6 次平行試驗(yàn)。同時(shí)與國標(biāo)微生物法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取5 組嬰幼兒配方乳粉，按1.3.3試樣制備的優(yōu)化方法處理試樣，并采用1.3.2試驗(yàn)所得的最適菌懸液濃度和培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系對(duì)每個(gè)試樣進(jìn)行6 次重復(fù)性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜菌懸液濃度與培養(yǎng)時(shí)間關(guān)系的確定

以測(cè)定試管的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同時(shí)間測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制不同濃度測(cè)試菌液的生長曲線，見圖1～4。

由圖1～4結(jié)果可知，營養(yǎng)物充足的情況下，隨著透光率的降低，菌懸液濃度增大，菌體進(jìn)入穩(wěn)定生長期越快，時(shí)間越短。圖1試管由于菌懸液濃度低，適應(yīng)期較長，在培養(yǎng)16～36 h之間處于適應(yīng)調(diào)整期，生長緩慢，吸光度值從0.098到0.298變化較小，測(cè)得吸光度值較圖2、3、4試管明顯偏低；圖2試管菌體經(jīng)過一段時(shí)期適應(yīng)后在16～40 h之間以最快的速度進(jìn)行繁殖進(jìn)入對(duì)數(shù)期，吸光度值變化明顯，在該時(shí)期內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的濃度影響菌的生長速率和總生長量，在40 h之后增速緩慢，到60h測(cè)得吸光度值無明顯變化，處于穩(wěn)定生長期；圖3、4試管由于菌懸液濃度較高，短時(shí)間內(nèi)16 h分別測(cè)得吸光度值0.686和0.759，直接處于對(duì)數(shù)生長期，且兩組試管分別在36 h和28 h進(jìn)入穩(wěn)定期，到60 h之后增速緩慢，測(cè)得吸光度值無明顯變化。

圖1 透光率90%濃度的測(cè)試菌懸液生長曲線

圖2 透光率70%濃度的測(cè)試菌懸液生長曲線

圖3 透光率50%濃度的測(cè)試菌懸液生長曲線

圖4 透光率30%濃度的測(cè)試菌懸液生長曲線

從該試驗(yàn)結(jié)果得知，圖2、3、4試管由于菌懸液濃度的逐步增大，菌體進(jìn)入穩(wěn)定生長期時(shí)間越短，分別在40 h、36 h和28 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期，當(dāng)生長因子葉酸耗盡，鼠李糖乳酸桿菌停止增長，不管培養(yǎng)時(shí)間的延長，測(cè)得吸光度值無明顯變化，因此可以利用終點(diǎn)法測(cè)定葉酸的含量。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，由于標(biāo)準(zhǔn)系列管中低濃度葉酸含量很低，如果菌懸液濃度較高（圖3、4 試管），會(huì)在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期甚至是衰老期，從而導(dǎo)致鼠李糖乳酸桿菌在標(biāo)準(zhǔn)系列管中均處于不同生長期，測(cè)得吸光度值有變化，最終影響試驗(yàn)結(jié)果。因此本次試驗(yàn)結(jié)果表明，該批次菌株儲(chǔ)備液用于葉酸測(cè)定時(shí)，將測(cè)定菌懸液透光率稀釋在70%、培養(yǎng)時(shí)間在40 h以上可以保證試驗(yàn)的可行性與穩(wěn)定性。

2.2 接種液優(yōu)化

GB 5009.211-2014中接種液的制備：先將儲(chǔ)備菌株連續(xù)傳種2～3 代以保證細(xì)菌活力（耗時(shí)3～4天）并且每月至少傳代1 次。試驗(yàn)前活化后的菌株再接種至瓊脂培養(yǎng)基中（37±1）℃培養(yǎng)20～24 h后，備用。然后試驗(yàn)前一天，取2 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和4 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液混勻，分裝于2 支5 mL離心管中，塞好棉塞，于121 ℃高壓滅菌15 min后即為種子培養(yǎng)液。冷卻后用接種環(huán)將活化的菌株轉(zhuǎn)至2支種子培養(yǎng)液中，于（37±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。試驗(yàn)當(dāng)天取出后將種子培養(yǎng)液混懸，無菌操作下用無菌注射器吸取0.5 mL轉(zhuǎn)接至另兩支已消毒但不含葉酸的培養(yǎng)液中，于（37±1） ℃培養(yǎng)6 h，振蕩混勻，制成接種液，立即使用。完成接種液制備，整個(gè)過程需要耗時(shí)4～5 天，操作繁瑣，制備時(shí)間長，并且由于菌株代數(shù)不同，活力不同，導(dǎo)致濃度也不易把握。再加上試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間和最終吸光度測(cè)定，完成一批樣品檢測(cè)總耗時(shí)6～7天。檢驗(yàn)時(shí)間過長，不利于大批量、任務(wù)緊急的檢測(cè)。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線-國標(biāo)微生物法

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線-優(yōu)化方法

本研究方法是將活力增強(qiáng)2～3代后的菌株預(yù)先用50 mL含有25%甘油的葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基混勻制成菌懸液并分裝1.0mL至菌株保存管，-70 ℃凍存?zhèn)溆?。每次試?yàn)時(shí)只需要拿出該批次菌株儲(chǔ)備液一支，凍融后，用0.85%生理鹽水稀釋至測(cè)定菌懸液透光率在70%可直接作為接種液使用，試驗(yàn)當(dāng)天可完成，節(jié)省了接種液的制備時(shí)間。其中甘油作為防凍劑防止冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線比較

確定該批次菌株儲(chǔ)備液適宜的菌懸液濃度為透光率T=70%、培養(yǎng)時(shí)間在40h以上，比較國標(biāo)微生物法和優(yōu)化方法所作標(biāo)準(zhǔn)曲線的差異，結(jié)果見圖5、6。

由圖5和圖6結(jié)果可知，兩種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，效果相當(dāng)，R2值可達(dá)到0.99以上。國標(biāo)微生物法是將試驗(yàn)用菌濃度和培養(yǎng)時(shí)間限定在一定范圍內(nèi)，但由于菌的生長規(guī)律存在一定的偏差，不同代數(shù)的菌株活力不同，因此使用相同菌濃度和培養(yǎng)時(shí)間往往不適用于不同代數(shù)的菌株生長，易造成結(jié)果不穩(wěn)定。而優(yōu)化方法固定同一批次菌株儲(chǔ)備液的菌懸液濃度為T=70%、接種量50 μL、37 ℃培養(yǎng)40 h以上，基本確保同一批次菌株的活力從而保證試驗(yàn)的穩(wěn)定性。

2.4 準(zhǔn)確性與重復(fù)性試驗(yàn)比較

本研究擬對(duì)樣品進(jìn)行簡單的水浴提取、稀釋，優(yōu)化樣品的提取步驟，結(jié)合菌株制備的優(yōu)化方法，對(duì)微生物法測(cè)定葉酸的含量進(jìn)行優(yōu)化，并將優(yōu)化方法應(yīng)用于檢測(cè)嬰幼兒乳粉中葉酸的含量。以質(zhì)控樣品SRM 1849a為基準(zhǔn)，使用優(yōu)化方法處理樣品，并選擇最適菌濃度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行6 次試驗(yàn)，比較優(yōu)化方法與國標(biāo)微生物法所測(cè)得結(jié)果的差異，結(jié)果見表1；同時(shí)，選取了5 種不同的嬰幼兒配方乳粉樣品，使用優(yōu)化方法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行6 次重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果見表2。以此對(duì)優(yōu)化方法進(jìn)行驗(yàn)證，為縮短檢驗(yàn)周期，提高試驗(yàn)效率。

由表1結(jié)果可知，兩種方法所測(cè)結(jié)果都與SRM 1849a中葉酸含量為229.3±6.2 ug/100 g標(biāo)示值相符，準(zhǔn)確性良好。相對(duì)于國標(biāo)微生物法，優(yōu)化方法結(jié)果更準(zhǔn)確，6 次平行試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD較小，可達(dá)1.61%。由表2結(jié)果可知，5組不同嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的RSD分別為1.74%、3.67%、4.36%、5.85%和4.00%。表明該方法重復(fù)性良好。

3 總結(jié)

GB 5009.211-2014微生物法檢測(cè)嬰幼兒乳粉中葉酸含量從菌種制備、試樣提取到接種培養(yǎng)等步驟繁瑣、復(fù)雜，存在易受外部因素干擾等問題，導(dǎo)致試驗(yàn)周期長，結(jié)果穩(wěn)定性、重現(xiàn)性差。而微生物法測(cè)定維生素的關(guān)鍵因素是試驗(yàn)菌株，多次傳代易造成菌株活力不同從而導(dǎo)致試驗(yàn)穩(wěn)定性不可控。本研究在GB 5009.211-2014基礎(chǔ)上作了兩點(diǎn)優(yōu)化：（1）優(yōu)化接種液制備，菌株儲(chǔ)備液預(yù)先分裝到菌株保存管中，通過比較菌株的生長規(guī)律，得出該批次菌株儲(chǔ)備液的適宜濃度和培養(yǎng)時(shí)間，確保同一批次的菌株活力基本一致，可以有效控制試驗(yàn)中接種液的濃度、添加量和培養(yǎng)時(shí)間。達(dá)到制備一次菌液可多次使用的目的。由原來的6～7 天縮減至2～3天，既節(jié)省了每次試驗(yàn)制備接種液時(shí)間，實(shí)現(xiàn)來樣當(dāng)天檢測(cè)，又保證了試驗(yàn)的穩(wěn)定有效。（2）試樣提取，國標(biāo)微生物法中對(duì)于嬰幼兒乳粉可采用直接提取法，但是也需要加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，超聲振蕩2～4 h，至試樣完全溶解或分散，然后用水定容至刻度等步驟。本研究表明，嬰幼兒乳粉直接用純水定容，經(jīng)95 ℃水浴30 min提取稀釋后可直接檢測(cè)葉酸，縮短了試樣制備需要超聲2～4 h。

綜上所述，本文對(duì)關(guān)鍵試驗(yàn)條件優(yōu)化研究，解決了接種液制備耗時(shí)長的問題；簡化試樣提取步驟，從而簡便了操作流程，縮短了檢驗(yàn)周期，減少多方面的干擾，具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，保證了試驗(yàn)的穩(wěn)定有效。該優(yōu)化方法提高工作效率，降低檢驗(yàn)成本，適合在實(shí)驗(yàn)室推廣和使用，對(duì)實(shí)驗(yàn)室開展微生物法檢測(cè)乳粉中葉酸的含量具有一定的指導(dǎo)意義。