馮俊祥，李 杰，2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

阿托伐他汀(Atorvastatin, ATV)是一種常用的他汀類藥物，能降低脂蛋白和膽固醇.越來越多的證據(jù)表明，他汀類藥物在缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中有顯著的保護作用[1-2].他汀類藥物除了具有抗炎作用以外，目前一些臨床數(shù)據(jù)也支持其具有潛在的抗癲癇作用[3-4].

炎癥過程中炎癥因子表達增加在癲癇發(fā)展中起著重要作用[5-6].IL-1β，IL-6，TNF-α等細胞因子被認為是癲癇發(fā)作后病理過程中的關鍵成分[7].由癲癇發(fā)作所引起的腦內(nèi)炎癥反應是導致腦組織病理改變，特別是海馬區(qū)損傷的主要原因之一.目前關于他汀類藥物治療能降低癲癇炎性因子表達水平以及對神經(jīng)細胞具有保護作用已有相關報道，但對于作用機制研究較少.

基于此，本研究以LI-PILO誘導的SD大鼠為癲癇動物模型，通過探討ATV對SD大鼠的行為學、炎性因子水平以及神經(jīng)細胞的影響，進一步對相關的作用機制作出分析，以期為篩選減輕癲癇發(fā)作癥狀和減少癲癇發(fā)作次數(shù)用藥提供理論參考.

1 材料與方法

造模前1周，ATV組分別給予不同劑量阿托伐他汀鈣連續(xù)1周灌胃處理，對照組給予等量生理鹽水；隨后均給予LI-PILO誘導癲癇發(fā)作，同時用閉路視頻監(jiān)測并記錄SD大鼠在急性期癲癇發(fā)作的不同時間點、癲癇發(fā)作級別及IV或V級SE發(fā)作的潛伏時間；繼續(xù)在靜止期記錄癲癇終止到第1次出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作的潛伏期；在慢性期，第7周給予連續(xù)1周的視頻監(jiān)測癲癇發(fā)作，第8周進行炎性因子檢測，同時行大腦海馬區(qū)尼氏染色，觀察神經(jīng)元受損情況.

圖1 實驗方案示意

1.1建立動物模型

1.1.1 實驗動物及分組 選取由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的健康成年雄性SD大鼠，體重180～200 g.實驗前飼養(yǎng)1周，隨機分為3組，每組各10只.10 mg ATV和50 mg ATV處理組(n=10)：分別給予 10 mg/kg ATV和50 mg/kg ATV灌胃.每天1次，連續(xù)1周.生理鹽水對照組(n=10)：給予同ATV處理組等量(2 mL)生理鹽水灌胃.每天1次，連續(xù)1周.

1.1.2 建立SE動物模型 按大鼠體重，分別給予腹腔注射127 mg/kg氯化鋰(美國Amresco公司).18 h后再給予腹腔注射45 mg/kg匹羅卡品(美國MCE公司).腹腔注射匹羅卡品前半小時，預先給SD大鼠腹腔注射1 mg/kg的硫酸阿托品以減輕匹羅卡品可能引起的外周癥狀.可根據(jù)Racine分級標準[8]來對大鼠進行癲癇發(fā)作程度的評估.具體標準如下：

0級：正常進食或活動狀態(tài)，無驚厥發(fā)生；

I級：靜止或伴咀嚼，觸須微動或頭部微顫；

II級：節(jié)律性點頭或抖動；

III級：單側前肢陣攣；

IV級：伴站立的全身強直陣攣；

V級：除IV級表現(xiàn)外，伴有失衡或者摔倒.

給予SD大鼠匹羅卡品應用后，觀察并記錄大鼠的行為及癲癇發(fā)作出現(xiàn)的時間.持續(xù)全身陣攣或每隔數(shù)分鐘接連出現(xiàn)全身陣攣發(fā)作稱為SE.當SD大鼠癲癇發(fā)作達到IV級或V級，即造模成功.在SE后1 h給予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作.成功造模生理鹽水對照組(n=6)，成功造模10 mg ATV組(n=6)和成功造模50 mg ATV組(n=6).

1.2 動物行為學研究

為了觀察ATV對SD大鼠在急性期癲癇發(fā)作程度的影響，腹腔注射匹羅卡品后(10,20，30，40，50 min)，用24 h視頻監(jiān)控系統(tǒng)觀察并記錄大鼠癲癇發(fā)作水平以及首次IV或V級SE發(fā)作的潛伏時間.癲癇程度評分與Racine標準相同；同時用視頻監(jiān)控系統(tǒng)觀察并記錄從SE發(fā)作終止到大鼠第一次出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作的潛伏期；在慢性期(腹腔注射匹羅卡品誘發(fā)SE后第6周至第7周)，用24 h視頻監(jiān)控系統(tǒng)連續(xù)觀察1周，記錄每只大鼠IV級或V級自發(fā)性發(fā)作次數(shù).自發(fā)性發(fā)作時的評分標準與急性期發(fā)作標準相同.

1.3 炎性因子的檢測

1.3.1 大鼠動脈血漿制備 按1.2 g/kg劑量給予SD大鼠腹腔注射20%烏拉坦溶液進行麻醉.仰臥位固定SD大鼠，用右手食指確定SD大鼠股動脈的位置和走行，沿股動脈方向于SD大鼠皮膚上行縱向切口.右手持注射器沿股動脈走行方向，往近心端穿刺取大鼠股動脈血.3 000 r/min離心10 min后，提取上清液并避光置于-70 ℃冰箱中儲藏備用.

1.3.2 ELISA法檢測血清IL-1β，IL-6，TNF-α水平 取出所需板條放置在框架內(nèi)，設置標準孔、樣品孔、本底校正孔.在酶標包被板上準確加樣標準品50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL.洗板5次，加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔).用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育60 min.然后再洗板(同上).每孔加入酶標試劑50 μL，用封板膜封住反應孔，避光室溫孵育20 min.最后再洗板(同上)，每孔先后加入顯色劑A和B各50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min.然后每孔加入終止液50 μL，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值).ELISA試劑盒由美國明尼阿波利斯研發(fā)系統(tǒng)公司提供.

1.4 免疫組化染色

1.4.1 腦片制備 對SD大鼠進行麻醉，方法同上.隨后研究人員對SD大鼠進行暴露并游離心臟，用吸有預冷過的生理鹽水的注射器從心尖部扎入左心室，同時用血管鉗固定針頭，然后用眼科剪剪開右心耳，灌注生理鹽水，直至從右心耳流出清亮液體.然后改為灌注預冷過的4%多聚甲醛，直至SD大鼠全身僵直即說明活體灌注固定完成.斷頭取出大鼠腦組織，置于4%多聚甲醛固定過夜，然后分別在15%和30%的蔗糖溶液中依次進行梯度脫水，用冷凍包埋機將腦組織切割成5 mm的連續(xù)切片，然后貼附于載玻片上于37 ℃溫度下過夜，再置于-80 ℃冰箱中儲藏備用.

1.4.2 尼氏染色 取含有海馬區(qū)的腦冠狀切面組織，在其周圍滴加OCT，冷凍后切片.然后分別移入含有PBS(磷酸鹽緩沖鹽溶液)的孔板中進行漂洗.隨后放置于PBS緩沖液中，再放置防脫片.然后取出玻片，室溫下干燥過夜后再用水濕化，隨后置于45 ℃的Nissl染液中浸泡20 min.用水清洗5 min后再用90%的乙醇分化數(shù)秒.在此期間用顯微鏡觀察到Nissl小體分化終止時，用95%和100%乙醇進行梯度脫水，再進行二甲苯透明處理，最后用中性樹膠封固.在海馬CA1，CA3，DG區(qū)分別用40倍物鏡隨機取5個視野計數(shù)正常結構神經(jīng)元，取均數(shù)作為此切片該區(qū)域的得數(shù).每組隨機取5張切片，采用Case Viewer軟件統(tǒng)計海馬CA1，CA3，DG區(qū)0.1 mm2區(qū)域內(nèi)陽性細胞數(shù)，取其平均值.Nissl染色液由Bioswamp提供.

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用均值±標準差(Mean±SD)描述.運用SPSS 23.0來統(tǒng)計分析，t檢驗評估兩組間的顯著性.運用單因素方差分析(ANOVA)，然后進行Bonferroni校正后檢驗比較各組間的差異.P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 SD大鼠行為學分析

預先給予10，50 mg/kg ATV應用后，在不同時間點(20，30，40 min)SD大鼠急性期癲癇發(fā)作的級別均顯著低于對照組(P<0.001和P<0.001)，表明給予ATV預處理能顯著減輕急性期癲癇發(fā)作級別(圖2(a)).10，50 mg/kg ATV組的SE發(fā)作潛伏時間較對照組顯著延長(P<0.05和P<0.01)，其中50 mg/kg ATV組SE發(fā)作潛伏期最長，表明給予ATV預處理能明顯延長急性期SE發(fā)作潛伏時間(圖2(b)).

與對照組相比，10，50 mg/kg ATV組自發(fā)性癲癇發(fā)作潛伏期顯著延長(P<0.05和P<0.05)，其中50 mg/kg ATV組自發(fā)性癲癇發(fā)作潛伏期最長，表明給予ATV預處理能明顯延長慢性期癲癇發(fā)作潛伏期(圖2(c)).與對照組相比，10，50 mg/kg ATV組自發(fā)性癲癇發(fā)作(SRSs)次數(shù)均顯著降低(P<0.05和P<0.001)，其中50 mg/kg ATV組自發(fā)性癲癇發(fā)作次數(shù)最少，表明給予ATV預處理能明顯減少慢性期自發(fā)性癲癇發(fā)作次數(shù)(圖2(d)).

圖2 大鼠癲癇行為發(fā)作分析

2.2 炎性因子表達分析

10，50 mg/kg ATV組IL-1β，IL-6，TNF-α炎性因子表達均明顯低于對照組(P<0.01和P<0.001).與10 mg/kg ATV組相比，50 mg/kg ATV組IL-1β的表達顯著增加(P<0.01)；IL-6，TNF-α的表達增加，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3).以上結果提示ATV可能通過降低IL-1β，IL-6，TNF-α炎性細胞因子在海馬區(qū)中的表達來延遲癲癇發(fā)作，降低癲癇發(fā)作級別.

圖3 SD大鼠血漿中炎性因子水平

2.3 尼氏染色分析

對海馬CA1，CA3，DG區(qū)神經(jīng)元進行尼氏染色及海馬錐體神經(jīng)元計數(shù)，尼氏染色結果顯示ATV組SD大鼠的海馬CA1，CA3，DG區(qū)有更多神經(jīng)元存活(圖4(a))，與對照組相比，10，50 mg/kg ATV組的陽性細胞總數(shù)均顯著增加(P<0.01和P<0.001)，同時50 mg/kg ATV組相比10 mg/kg ATV組陽性細胞總數(shù)明顯增加(P<0.01)(圖4(b))，以上結果提示ATV對SD大鼠癲癇模型的海馬區(qū)神經(jīng)元具有保護作用.

圖4 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元染色及陽性細胞數(shù)

3 討論

癲癇發(fā)作促使腦神經(jīng)元損害的關鍵作用機制之一是癲癇后的炎性神經(jīng)反應，IL，TNF-α等炎性因子在此過程中發(fā)揮著關鍵作用.IL-1β，IL-6，TNF-α等炎性因子通過多種機制為癲癇發(fā)作提供微環(huán)境，使癲癇發(fā)作易感性增加[9].通過對SD大鼠在急性期癲癇發(fā)作的行為學觀察發(fā)現(xiàn)，ATV組癲癇發(fā)作的潛伏時間顯著延長，同時癲癇發(fā)作級別顯著降低，這與Wang等[10]的研究一致，提示ATV能縮短潛伏時間，同時能使癲癇發(fā)作級別顯著降低.而在LI-PILO應用10，50 min后ATV組癲癇發(fā)作級別較對照組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能與樣本數(shù)量、動物模型和個體差異有關.Citraro等[11]研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可使大鼠促炎癥因子下降進而抑制氧化應激反應和腦部炎癥，在癲癇發(fā)作時他汀類藥物發(fā)揮腦保護功能，減少癲癇發(fā)作.ATV組癲癇發(fā)作潛伏期延長，慢性期自發(fā)性癲癇發(fā)作的次數(shù)明顯減少，提示ATV影響癲癇發(fā)作形成與以上機制有關.

在正常機體腦細胞中，IL-1β，IL-6，TNF-α炎癥因子的表達保持在很低的水平.在癲癇發(fā)作的半小時內(nèi)，IL-1β，IL-6，TNF-α炎癥因子的含量會迅速增加[12].他汀類藥物可減少IL-1β，IL-6，TNF-α炎癥因子的釋放，進而達到抗炎、抗氧化的作用.同時他汀類藥物可通過上調(diào)GABA活性和下調(diào)谷氨酸活性，使神經(jīng)元免受興奮性毒性的損傷.他汀類藥物通過上述炎癥因子及活性物質的共同作用發(fā)揮保護血腦屏障的功能[13-14].同時IL-6，TNF-α介導了IL-1β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的諸多病理過程[15].ATV通過降低癲癇SD大鼠IL-1β，IL-6，TNF-α炎癥因子的表達，進而影響癲癇的發(fā)生發(fā)展過程，阻止癲癇的發(fā)生.在慢性期的尼氏染色中，ATV組的陽性細胞總數(shù)顯著增加與前人研究結果類似[2,16]，表明ATV對癲癇動物模型的神經(jīng)元具有保護作用.ATV組中海馬CA1，CA3，DG區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目均明顯高于對照組，同時50 mg/kg ATV組比10 mg/kg ATV組提升效果更好.以上結果提示ATV可通過降低癲癇發(fā)生發(fā)展過程中炎癥因子引起的炎癥級聯(lián)反應而保護神經(jīng)元，且ATV劑量大小與保護效應成正相關.

綜上，在SD大鼠癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中，ATV可通過抑制海馬區(qū)中IL-1β，IL-6，TNF-α炎癥因子的生成，延長癲癇發(fā)作潛伏時間和降低癲癇發(fā)作頻率等方式來減輕急性期及慢性期癲癇發(fā)作.雖然ATV在動物實驗中已被證實能夠減輕癲癇發(fā)作癥狀，但在臨床上的療效仍需進一步的試驗證實.