朱長明，孫 高，陳功華，龔于剛，夏 杰

(1.吉首大學(xué)附屬張家界市人民醫(yī)院胃腸外科，湖南 張家界 427000；2.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率極高，胃癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，在實體腫瘤的成長過程中伴隨著復(fù)雜的微環(huán)境改變，而缺氧微環(huán)境的誘導(dǎo)是加劇胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素.因此，探討缺氧條件下胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制至關(guān)重要[1-3].長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸且不具有蛋白質(zhì)編碼功能的長鏈RNA分子，具有豐富的生物學(xué)功能[4-5].目前，大量研究已證實LncRNA在缺氧誘導(dǎo)的胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重大作用.LncRNA-ROR(Regulator of Reprogramming)，是最近發(fā)現(xiàn)的對細(xì)胞重編程過程具有重要調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA[6-7]，目前研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-ROR在乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、腎癌等腫瘤中存在差異表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥等方面發(fā)揮重要的調(diào)控功能[8-11].然而，LncRNA-ROR在缺氧誘導(dǎo)胃癌中的作用尚不清楚.基于此，本研究采用基因重組技術(shù)過表達(dá)LncRNA-ROR，研究其對缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響.

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年8月至2013年3月收集30例廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院胃腸外科胃癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本(配對癌旁正常組織距離癌灶5 cm以外)，所選患者術(shù)前均未接受放化療.所有收集的樣本均立即放入液氮凍存，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，整個收集及保存過程均按照無酶操作原則進(jìn)行.本研究經(jīng)廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入患者均在術(shù)前簽署知情同意書.

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901購于中科院上海細(xì)胞庫，MGC-803和SGC-7901均用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司11875-093)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱和37 ℃、5%CO2+1%O2+94%N2的缺氧孵箱中培養(yǎng).取狀況良好、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗.

1.3 基因重組及慢病毒轉(zhuǎn)染LncRNA-ROR

過表達(dá)序列(LV5-ROR)的設(shè)計與合成及慢病毒載體構(gòu)建、包裝均由上海生工生物工程有限公司完成.ROR空載體(LV5-NC)作為對照，利用慢病毒法進(jìn)行細(xì)胞感染，培養(yǎng)3～4 d后采用實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測LncRNA-ROR過表達(dá)效果.

1.4 總RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR檢測

利用RNAiso Plus裂解液(日本TaKaRa公司，9109)提取組織及細(xì)胞的總RNA，PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，RR047A)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Premix Ex Taq II(日本TaKaRa公司，RR820L)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng).以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，引物序列購于上海生工生物工程有限公司.LncRNA-ROR引物上游序列：CCAGGACAATGAAACCAC；下游序列：AGGAGCCCAAAGTAACAG.GAPDH引物上游序列：GTCAACGGATITGGTCTGTATT；下游序列：AGTCTTCTGGG-TGGCAGTGAT.

1.5 細(xì)胞遷移及侵襲試驗

用無血清培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞配置成細(xì)胞懸液，遷移試驗細(xì)胞濃度為4×104個，侵襲試驗細(xì)胞濃度為1×105個；取100 μL細(xì)胞懸液加入小室的上室，下層小室為500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，分別置于常氧、缺氧培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出小室，用棉簽輕拭小室上層，下層于-20 ℃下用4%多聚甲醛固定15～20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS溶液洗去殘余的結(jié)晶紫并風(fēng)干，倒置于400倍顯微鏡(Tsl00，13本Nikon公司)下觀察，每個樣本隨機(jī)取5個視野，取其平均值作為細(xì)胞的遷移及侵襲數(shù)量.每組試驗均重復(fù)3次以上.

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，配對資料間使用獨(dú)立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 ROR mRNA在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)

通過RT-PCR法檢測30例患者胃癌組織及癌旁組織中ROR mRNA表達(dá)水平.結(jié)果表明，ROR mRNA的在胃癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織(圖1).

圖1 RORmRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2 ROR mRNA在缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯下調(diào)

通過RT-PCR法檢測了在缺氧誘導(dǎo)下胃癌細(xì)胞系SGC-7901及MGC-803中ROR mRNA表達(dá)水平.結(jié)果表明，在缺氧誘導(dǎo)下，SGC-7901及MGC-803中ROR mRNA表達(dá)水平明顯降低且均在缺氧16 h時最低(圖2).

圖2 ROR mRNA在缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系SGC-7901及MGC-803中的表達(dá)情況

2.3 基因過表達(dá)技術(shù)增高ROR mRNA在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

利用基因過表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建ROR mRNA過表達(dá)的LV5-ROR慢病毒載體，以空載的LV5-NC慢病毒載體作為對照，利用慢病毒法轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MGC-803，再采用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ROR mRNA表達(dá)水平.如圖3所示，與空載對照組相比，轉(zhuǎn)染LV5-ROR細(xì)胞系中的ROR mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.001).

圖3 ROR mRNA在胃癌細(xì)胞SGC-7901及MGC-803中的過表達(dá)效果(***P<0.001)

2.4 ROR mRNA在缺氧誘導(dǎo)下抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移

Transwell遷移及侵襲試驗結(jié)果表明，在缺氧條件下SGC-7901與MGC-803的侵襲能力明顯增強(qiáng).而在缺氧條件下，與LV5-NC相比，LV5-ROR轉(zhuǎn)染SGC-7901和MGC-803后，兩種胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力均明顯降低(圖4，5).

圖4 缺氧條件下過表達(dá)ROR mRNA后對胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響(**P<0.01)

圖5 缺氧條件下過表達(dá)ROR mRNA后對胃癌細(xì)胞MGC-803侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響(**P<0.01)

結(jié)果證實了缺氧能夠顯著增加SGC-7901和MGC-803的侵襲、轉(zhuǎn)移能力；在過表達(dá)ROR mRNA后，缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯下降，這充分表明了在缺氧條件下ROR mRNA能抑制胃癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移.

3 討論

在眾多腫瘤疾病中，胃癌的發(fā)病率及死亡率均居前列，而在占全球胃癌患者總數(shù)60%的亞洲國家中，中國是胃癌患者最多的國家.盡管診療技術(shù)在不斷提高，以手術(shù)治療為主的綜合治療手段越來越豐富，但胃癌的預(yù)后仍然很差，影響胃癌患者預(yù)后的主要因素是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12-13].眾所周知，在實體腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中，普遍存在缺氧現(xiàn)象，缺氧能改變腫瘤生長的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤多種惡性表型發(fā)生，在缺氧誘導(dǎo)下，眾多基因表達(dá)高度異常，通過各種不同的作用機(jī)制刺激腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[14-16].

在過去幾十年里，專家學(xué)者致力于蛋白編碼基因的相關(guān)研究，但在人類基因組序列中，有超過98%的序列并不能編碼蛋白質(zhì)，而LncRNA曾一度被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄噪音而未受到重視.現(xiàn)在大量的數(shù)據(jù)表明，LncRNA具有豐富的生物學(xué)功能，其廣泛的調(diào)控機(jī)制及在疾病進(jìn)程中作用越來越受到人們的重視[17-18].LncRNA-ROR位于第18號染色體，全長2.6kb，由4個外顯子組成.2010年科研人員在研究LncRNA與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，ROR可通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞重編程過程[6].

本研究結(jié)果表明，在胃癌組織中，ROR mRNA的表達(dá)量明顯低于癌旁組織；此外，在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系8，16，20，24 h后，檢測ROR mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)后ROR mRNA的表達(dá)量明顯降低，由此證明在缺氧誘導(dǎo)下，ROR mRNA在胃癌中存在差異表達(dá).隨后本研究構(gòu)建了ROR mRNA過表達(dá)的LV5-ROR慢病毒載體，通過慢病毒法轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MGC-803，再利用Transwell小室試驗研究在缺氧誘導(dǎo)下LV5-ROR對胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力的影響.結(jié)果表明，在缺氧條件下，過表達(dá)ROR mRNA后，胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯降低，由此證明ROR mRNA在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用.本研究初步揭示了在缺氧誘導(dǎo)條件下LncRNA-ROR對胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移的作用，但其具體機(jī)制仍不清楚，有待一步研究，為將來胃癌的診斷及治療提供研究基礎(chǔ).

4 結(jié)論

LncRNA-ROR在胃癌中存在差異表達(dá)，ROR mRNA在胃癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織；在缺氧誘導(dǎo)下，胃癌細(xì)胞中ROR mRNA表達(dá)明顯下降；缺氧時過表達(dá)ROR mRNA能夠明顯抑制SGC-7901及MGC-803細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移.綜上，LncRNA-ROR具備抑制胃癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的能力，可為胃癌靶向治療提供理論依據(jù).