靳 博 綜述，向 征 審校

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 400016)

結直腸癌(CRC)在惡性腫瘤中發(fā)病率高達第四，病死率高居第二[1]。由于我國居民飲食向著低纖維、高蛋白脂肪結構轉變，CRC發(fā)病率仍不斷升高[2]。手術后腫瘤復發(fā)或遠處轉移，并因此繼發(fā)各種嚴重并發(fā)癥，是CRC患者死亡的主要原因。即使采用根治性手術并輔以化療后，仍有近1/2的Ⅱ～Ⅲ期CRC患者會發(fā)生復發(fā)轉移。因此，早期識別預后不良的患者，并予以更積極的治療措施，對提升這部分CRC患者的生活質量及預后意義非凡。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)是能夠監(jiān)測治療效果并預測腫瘤患者預后的指標，是指因各種原因脫離原發(fā)實體腫瘤，進入血液并游離其中的腫瘤細胞。大部分腫瘤細胞進入外周循環(huán)后由于血液的剪切力、缺氧、機體的免疫識別、自身凋亡等因素會迅速死亡，僅少量存活。殘存的CTC可聚集并黏附形成微小癌栓，隨血流進入全身各處。在微環(huán)境適宜的靶器官中，CTC若逃避了免疫系統(tǒng)的識別，則可增殖形成轉移灶。因此，腫瘤的血行轉移與CTC緊密相連。因CTC來源于原發(fā)灶，與原發(fā)灶腫瘤細胞的抗原表達、基因突變情況、生物學行為高度相同，故可用于惡性腫瘤的“液體活檢”[3]。因此，CTC在CRC的早期診斷、檢測腫瘤復發(fā)轉移、評估預后、指導治療等方面具有重要意義，本文就CTC在CRC中的應用做一綜述。

1 CTC的亞型

根據(jù)細胞分子生物特性，CTC可分為多個亞型。第一類是上皮性腫瘤細胞，和原發(fā)實體灶一樣主要表達上皮性抗原的腫瘤細胞。第二類為經(jīng)上皮-間質轉化(EMT)的腫瘤細胞。不同于細胞化生，EMT的細胞丟失上皮特征性的基因表達、細胞形態(tài)、表面抗原后，轉變?yōu)轭愃朴陂g充質來源的細胞。此過程對于胚胎發(fā)育、修復受損組織十分重要。上皮來源腫瘤發(fā)生EMT時，會使腫瘤細胞原本高表達的上皮細胞特異性基因表達下調，而間質細胞特性的基因表達上調，使得上皮細胞特征性的E-鈣黏蛋白水平大幅降低，而對應的間質細胞特征性蛋白顯著升高，從而使其遷移、降解胞外基質等侵襲能力增強。同時，腫瘤細胞丟失極性，連接松散，也更容易穿越組織間質、基底膜向血管內滲成為CTC[4]。此過程在腫瘤形成早期既可發(fā)生，甚至可早于肉眼可見的腫瘤灶形成之前[5]。這種游離在外周血中、侵襲能力較強、具有間充質特性的腫瘤細胞就是EMT腫瘤細胞[6]。相較于上皮型CTC，EMT型CTC在預測CRC患者預后、評價療效等方面更具優(yōu)勢，因其與CRC的疾病分期及血行轉移關系更為密切，作為腫瘤生物標志物其價值更大，預測的各項結果更為精確[7]。但由于CTC研究的復雜性，現(xiàn)階段許多檢測方法主要針對上皮性CTC，對EMT型CTC的檢測仍有待深入。最后一類為腫瘤干細胞(CSCs)，CSCs具有多向分化能力，在微環(huán)境適宜的靶器官中逃避免疫系統(tǒng)攻擊后，可分化增殖產(chǎn)生異質性腫瘤細胞，產(chǎn)生轉移灶。因此，原發(fā)灶的血行轉移與能夠自我更新的CSCs密不可分。KOJIMA等[8]觀察了189例CRC術后標本的腫瘤細胞CD133表達水平，發(fā)現(xiàn)CD133陽性組患者比CD133陰性組患者總生存率(OS)更低，表明CD133陽性表達可獨立提示CRC患者預后差，間接說明CSCs的存在與患者預后不良具有一定關聯(lián)。

2 CTC的富集與檢測

CRC患者CTC經(jīng)腸系膜靜脈匯入門靜脈再進入肝臟，大部分會被肝竇中的庫普弗細胞及其他免疫細胞殺滅，殘存的腫瘤細胞再隨心臟射血分散到全身外周血，因此，腸系膜靜脈及門靜脈血中的CTC水平高于外周靜脈血。CTC相互聚集黏附，會降低單位血液中的腫瘤細胞密度，對檢測造成一定影響，若3個及以上的CTC形成細胞腫瘤聚合體，則被稱為CTC cluster。MOLNAR等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CTC cluster與EMT腫瘤細胞密切相關，且其轉移能力比單個CTC強。ACETO等[10]也發(fā)現(xiàn)，外周血中檢出CTC cluster的患者比僅檢出單個CTC的患者，腫瘤轉移概率高25～30倍。CTC的水平很低，約100～1 000萬個血細胞中僅有1個CTC。因此，要發(fā)現(xiàn)外周血中如此稀少的CTC，要先對其富集，再驗證所獲細胞是否為目標細胞。

2.1物理富集法 根據(jù)物理性質不同，將腫瘤細胞從血細胞中篩選出來的方法被稱為物理富集法，如Oncoquick系統(tǒng)、ISET系統(tǒng)。通常CRC細胞體積和密度大于血細胞，通過物理特性而富集的CTC，因完整保留了細胞的表面抗原及結構，可繼續(xù)行免疫組織化學、熒光染色，進一步研究基因表達情況。物理富集法簡單易行且價格低廉，但缺點同樣明顯:特異性不高。在膜濾過分離法中，體積較小或細胞形態(tài)改變的腫瘤細胞可能通過濾過膜，某些直徑較大的非腫瘤細胞(如大于8 μm的單核細胞)可能會被濾過膜截留；而密度梯度離心法可能出現(xiàn)腫瘤細胞及血細胞的遷移影響富集效果，特異性不高，可出現(xiàn)假陽性。

2.2免疫富集法 免疫富集法包括正向和負向富集兩種，主要利用磁珠表面固定的特異性抗體與細胞表面對應抗原結合并形成復合物，從而將目標細胞固定在磁珠上，在磁場中與其他未被固定細胞分離,最終富集CTC。其中，正向富集的特異性抗體與CTC表面的特異性腫瘤抗原(如CK20、EpCAM等)結合，直接富集CTC。目前，唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市的Cell Search系統(tǒng)就屬于免疫磁珠正向富集系統(tǒng)。它能捕獲血液中EpCAM陽性細胞，再用CD45抗體和CK抗體區(qū)分白細胞和腫瘤細胞，所獲CTC純度較高。但是，EMT機制會導致腫瘤細胞的上皮性抗原減少，系統(tǒng)無法有效捕獲EpCAM低表達的EMT腫瘤細胞，可能出現(xiàn)假陰性[11-12]。負向富集法過程類似正向富集，但其使用白細胞特異性抗體(如抗CD45)，其與白細胞表面抗原結合形成復合物后，可去除樣本血液中的白細胞，反向富集目標CTC，因此不受EMT機制導致的腫瘤細胞上皮特征性抗原減少等因素影響，可用于所有上皮來源實體腫瘤且無視表面抗原的變化。其缺點是富集過程中少量的白細胞殘留會明顯影響細胞純度。在實際工作中正、負向富集法常聯(lián)合使用以提高檢測效率。

2.3富集細胞驗證 富集獲得的細胞還需檢測驗證是否確為CTC，驗證方法包含核酸檢測法和細胞計數(shù)法。聚合酶鏈反應(PCR)屬于核酸檢測法，無法直接觀察并計數(shù)CTC。使用PCR可檢測外周血中的癌基因或抑癌基因DNA片段，簡單易行，但因原發(fā)腫瘤細胞裂解時DNA片段釋放入血，在血液循環(huán)可能已存在一段時間，因此檢測到外周血中有腫瘤DNA片段，并不能直接證明血液中存在腫瘤細胞，故此法不適用于臨床CTC檢測。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)也是核酸檢測法，可通過檢測外周血中特定的逆轉錄DNA片段來證實CTC的存在。與PCR法不同的是，RT-PCR檢測的對象為腫瘤細胞特定mRNA的逆轉錄DNA，通常癌胚抗原(CEA)、細胞角質蛋白19(CK19)等癌基因的mRNA在血液中并不存在，即使釋放到血液中后也會很快被各種RNA酶降解，因此，只要RT-PCR在擴增后檢測到外周血中CEA、CK19對應的特定逆轉錄DNA，即可間接證明CTC的存在，并可推斷出CTC水平。此法也無法直接觀察和計數(shù)CTC，可能受惡性腫瘤伴隨炎癥導致的腫瘤mRNA、上皮細胞污染血液樣本、腫瘤基因異常表達等情況的影響。免疫細胞化學法(ICC)可直接觀察和計數(shù)CTC。ICC技術將顯色劑與針對腫瘤抗原的特異性抗體結合，其與腫瘤細胞表面抗原發(fā)生抗原抗體反應，實現(xiàn)腫瘤細胞的顯色，所獲細胞可進一步行熒光原位雜交(FISH)來研究CTC的基因表達、突變情況。缺點是目前所用特異性抗體(如CK)特異性不高，仍會受巨噬細胞、漿細胞表面抗原干擾，導致結果出現(xiàn)假陽性。流式細胞分析技術(FCM)與ICC類似，它使用被特殊熒光標記的特異性抗體，抗體與腫瘤細胞對應抗原結合時即可對腫瘤細胞進行標記和流式細胞檢測，直接計數(shù)CTC。該法獲得的細胞可在基因層面、蛋白水平、細胞形態(tài)等方面進一步開展研究。FCM技術也因抗體特異性不高，面臨著檢測結果特異性、敏感性較低的問題。在實際工作中，為提高檢測效率，常常聯(lián)合2種或多種方法進行CTC的檢測。

3 CTC的應用及挑戰(zhàn)

CTC已被用于轉移性乳腺癌、前列腺癌、CRC的檢測，但仍面臨某些問題，如各檢測方法各異不利于臨床研究、檢測時間節(jié)點無一致標準、cut-off值尚無統(tǒng)一標準等等，同時，仍需開發(fā)特異性更高的腫瘤抗原及相應抗體，以提高檢測結果的可信度并兼顧EMT型CTC。能為臨床提供更多信息的新型CTC檢測手段也在不斷出現(xiàn)，如單細胞測序隨著基因組學技術進步而成為目前研究熱點，可對CTC進行DNA擴增，實現(xiàn)對單個CTC的基因測序，以此研究CTC及原發(fā)灶腫瘤細胞基因表達、突變情況。當無法獲取患者原發(fā)或轉移灶腫瘤細胞時，可通過CTC進行腫瘤基因突變及耐藥情況的動態(tài)監(jiān)測。GAO等[13]通過單細胞測序對比了23例腫瘤患者的CTC、原發(fā)灶腫瘤細胞、轉移灶腫瘤細胞的拷貝數(shù)變異(CNV)，發(fā)現(xiàn)CTC與轉移灶細胞的CNV模式極為相似，同時部分CTC與原發(fā)灶CNV模式相同，提示這些原發(fā)灶具有轉移潛能。

4 CTC在CRC中的應用

4.1早期診斷CRC Ⅰ～Ⅱ期CRC預后較好，但已有遠處轉移的患者，其5年生存率較早期患者迅速跌至10%～20%[14-15]。CRC早期癥狀不明顯，許多患者確診時分期較晚，腫瘤已穿透全層腸壁至周圍組織器官或已有轉移，故早發(fā)現(xiàn)、早治療能有效改善CRC患者預后。CRC發(fā)病早期就可有腫瘤細胞進入外周血，發(fā)現(xiàn)CTC有助于腫瘤早期診斷[16]。糞便隱血試驗快捷、廉價，但特異性低，常受到腸道炎癥、痔等因素影響；CEA、糖類抗原199(CA199)等腫瘤標志物升高常提示腫瘤性疾病，但缺乏特異性，受某些良性疾病影響，且有許多CRC患者腫瘤標志物水平并不升高。腸鏡檢查可發(fā)現(xiàn)早期CRC甚至息肉等癌前病變等，檢查前需進行機械性腸道準備，某些患者甚至不能耐受腸鏡檢查，腸鏡檢查也不能實時觀察腫瘤的生長變化情況，不易常規(guī)實施。CT檢查具有輻射，且只能發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病變，結果存在一定的滯后性。相較以上檢查項目，CTC檢查只需抽取外周靜脈血，具有方便、實時、微創(chuàng)的優(yōu)點，在CRC早期診斷方面有獨特優(yōu)勢。CTC也可同時篩查其他某些腫瘤性疾病。張波等[17]研究指出，當以0作為7.5 mL外周血中CTC數(shù)目的cut-off值時，CTC檢出早期CRC的敏感度為63.3%(19/30)，且其水平與疾病分期、腫瘤分級呈正相關。WENSY等[18]研究顯示，CTC檢出Ⅰ～Ⅳ期CRC的敏感度為86.9%，特異度為97.3%，準確度遠高于糞便隱血試驗。

4.2檢測腫瘤復發(fā)轉移 通過研究有肝臟和骨微轉移灶的CRC患者，MOHAJERI等[19]證實CTC可預測腫瘤復發(fā)轉移風險。遠處轉移仍是消化道腫瘤患者死亡的主要原因[20]，在首次原發(fā)灶切除術后3年內，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)轉移能為某些患者爭取再次治療的機會。影像學及腸鏡只能發(fā)現(xiàn)人眼可見的較大病灶，兩者無法對更早期的微小轉移瘤進行預警，而CTC數(shù)目的變化趨勢可早期預測可能的腫瘤復發(fā)轉移，甚至其預測結果準確度高于腫瘤標志物及正電子發(fā)射計算機斷層掃描(PET-CT)[21]，CTC也能比CRC相關腫瘤標志物更早、更靈敏地反映腫瘤復發(fā)轉移[22]，具有為患者爭取再次治療機會的潛力。國內學者統(tǒng)計了1 847例CRC患者數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有轉移患者的CTC數(shù)目明顯高于無轉移患者，而有肝轉移瘤患者的CTC檢出數(shù)顯著高于肝轉陰性患者[23`]。TIEN等[24]的研究也指出,門靜脈中CTC的數(shù)量可較準確地預測患者術后肝轉移發(fā)生概率，證明CTC可預警影像學陰性的肝臟轉移。姚月娟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在CRC患者中，復發(fā)轉移患者檢出CTC率比首次診斷患者約高40%，也證明CTC可用于檢測有無腫瘤復發(fā)轉移。

4.3評估預后 CTC作為一種潛在的微轉移灶，其計數(shù)及其動態(tài)變化過程，尤其是在圍手術期的變化趨勢可用于預測腫瘤患者預后[26]，其與TNM分期聯(lián)合應用可更精確預測患者預后[27-28]。薈萃分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)CTC數(shù)量基線將患者分為高數(shù)量組和低數(shù)量組，高數(shù)量組的OS和無進展生存期(PFS)均低于低數(shù)量組，預后明顯更差(P<0.001)。對CTC動態(tài)隨訪結果進一步分析發(fā)現(xiàn)，由原本低數(shù)量組增加轉變?yōu)楦邤?shù)量組的患者，預后差于從高數(shù)量組降低為低數(shù)量組的患者，相應的OS和PFS同樣更短[29]。薈萃分析統(tǒng)計了2 363、3 129例CRC患者外周血CTC數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)無論TNM分期、采樣時間、是否有過新輔助治療、檢測方法，CTC陽性均意味著更差的OS與PFS。CTC可獨立預測CRC患者預后不良。同時，CTC檢出數(shù)量與腫瘤局部分期、局部淋巴結轉移、TNM分期、血管受侵情況緊密相關。這些證據(jù)均表明CTC比影像學檢查可更好，能更早期地預測患者預后[30-31]。奚天益[32]的薈萃分析結果也證實，CTC數(shù)目與CRC的T分期、TNM分期等呈正相關。

4.4評估化療效果 傳統(tǒng)的RECIST標準以治療后腫瘤大小變化來判斷治療效果，但某些情況下化療后腫瘤的影像學體積無明顯變化；而CTC在化療前后計數(shù)變化趨勢聯(lián)合其他腫瘤標志物的變化，可補救RECIST標準中依賴影像學檢查，導致某些情況無法準確評估療效的欠缺。TAN等[33]研究轉移性CRC化療過程中CTC和腫瘤標志物變化情況，發(fā)現(xiàn)CTC更能反映療效及病情進展狀況。

4.5指導個體化治療 現(xiàn)階段腫瘤的治療要求醫(yī)務工作者根據(jù)患者病情、經(jīng)濟狀況、化療敏感度、不良反應等綜合制定最佳的個體化治療措施。靶向藥物特異性強、不良反應少，但某些患者天然耐藥，且初始敏感患者在靶向治療過程中可能出現(xiàn)獲得性耐藥，因此監(jiān)測靶向藥物應用過程中患者的耐藥情況，對更換治療方案極為重要。BUIM等[34]研究報道，70%原發(fā)灶腫瘤細胞與CTC的Kras突變相同。MUSELLA等[35]研究亦發(fā)現(xiàn)，可通過對CTC基因檢測，判斷腫瘤對抗表皮生長因子受體靶向治療是否敏感。YANG等[36]對正在靶向治療的轉移性CRC患者連續(xù)監(jiān)測CTC的Kras突變情況，發(fā)現(xiàn)有30%的Kras初始野生型患者在靶向治療中發(fā)生了突變。因此，在靶向藥物應用過程中，可利用CTC隨訪腫瘤Kras突變情況，避免無效的靶向治療。CTC還可幫助醫(yī)師選擇化療藥物。ABDALLAH等[37]研究顯示，對CTC上胸苷酸合成酶進行測定，可了解腫瘤對5-FU的耐藥情況以此判斷患者在氟尿嘧啶(5-FU)應用中能否獲益。對CTC基因、分子層面的動態(tài)監(jiān)測，可幫助醫(yī)務工作者合理利用靶向、化療藥物，及時制定敏感的治療方案，并減少耐藥藥物相關的不良反應和患者不必要的經(jīng)濟負擔。

5 總結與展望

CTC目前已用于預測CRC、乳腺癌、前列腺癌的預后[38-39]，其技術仍在快速進步，檢測準確度也在不斷提高，深入檢測的單細胞組學結果也能為臨床提供更多極具價值的信息。CTC檢測不僅方便、微創(chuàng)，可用于CRC的早期診斷，其連續(xù)動態(tài)檢測結果的變化趨勢，對CRC療效評估及預后判斷有較大的實用價值，并可輔助制定個體精準治療方案。當然，CTC也面臨某些亟需解決的問題：現(xiàn)存的各種檢測方式結果有較大差異[40]；需要采用統(tǒng)一的檢測技術，找到最佳的cut-off值，開發(fā)更具特異性且兼顧EMT型CTC的腫瘤標志性抗原，提高檢測結果的準確度。此外，進一步明確CTC與CRC轉移、預后的關系，可使其發(fā)揮更重要的作用。CHEN等[41]發(fā)現(xiàn)，上皮細胞轉化序列2基因在CRC患者和健康受試者之間差異表達比例較高(P<0.01)，可幫助提高CTC敏感度及特異度。當前CTC為臨床工作提供的信息主要為分選計數(shù)和倍體，但高通量測序技術的迅速發(fā)展，將使單細胞組學成為CTC的重要發(fā)展方向。不同CTC亞群在CRC發(fā)生、發(fā)展、轉移中發(fā)揮各自的作用，有必要充分利用單細胞組學對各亞群深入探究，明確其在CRC中的作用。其中，具有干細胞特性的循環(huán)腫瘤干細胞(CTSCs)可能是早期發(fā)現(xiàn)和阻止腫瘤發(fā)生、轉移的重要環(huán)節(jié)，相較上皮型CTC，更加稀少、神秘的CTSCs可能值得更深入探究。